[發明專利]一種用于銅綠假單胞菌環介導等溫擴增引物、試劑盒及其檢測方法

在審

• 申請號: 201711319150.9
• 申請日: 2017-12-12
• 公開（公告）號: CN109913561A
• 公開（公告）日: 2019-06-21
• 發明（設計）人: 周勇;項周
• 申請（專利權）人: 重慶威斯騰生物醫藥科技有限責任公司
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6844;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/385
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.用于銅綠假單胞菌環介導等溫擴增引物，其特征在于：根據該菌特異性基因PAK的序列的六個區域設計三對特異引物。

2.根據權利要求1所述的用于銅綠假單胞菌環介導等溫擴增引物，其特征在于：所述三對引物如下：

FIP、BIP引物，序列分別見序列表 SEQ ID NO.1～2；

F3、B3引物，序列分別見序列表SEQ ID NO.3～4；

LF、BF引物，序列分別見序列表SEQ ID NO.5～6。

3.用于銅綠假單胞菌環介導等溫擴增檢測試劑盒，其特征在于：包括權利要求1和2所述的引物。

4.用于銅綠假單胞菌環介導等溫擴增檢測試劑盒，其特征在于：還包括DNA快速提取試劑、陰性對照品、陽性對照品、顯色試劑、Bst DNA聚合酶及反應液等試劑。

5.根據權利要求4所述的銅綠假單胞菌環介導等溫擴增檢測試劑盒，其特征在于：所述DNA快速提取試劑為Easy Extract（重慶威斯騰生物有限公司提供）。

6.根據權利要求4所述的銅綠假單胞菌環介導等溫擴增檢測試劑盒，其特征在于：所述陰性對照品為生理鹽水。

7.根據權利要求4所述的銅綠假單胞菌環介導等溫擴增檢測試劑盒，其特征在于：所述陽性對照品為含有PAK基因的質粒，所述PAK基因序列見序列表SEQ ID NO.7。

8.根據權利要求4所述的銅綠假單胞菌環介導等溫擴增檢測試劑盒，其特征在于：所述顯色試劑為鈣黃綠素與氯化錳混合物，其配方為50 μM鈣黃綠素溶液與500 μM氯化錳溶液等比例混合。

9.根據權利要求4所述的銅綠假單胞菌環介導等溫擴增檢測試劑盒，其特征在于：所述反應液含有以下試劑：1. 4M betaine , 200 μM dNTPs , 1×Isothermal AmplificationBuffer Ⅱ, FIP/BIP引物各1.6 μM, F3/B3引物各0.2μM，LF/LB引物各0.4Μ。

10.一種銅綠假單胞菌環介導等溫擴增檢測方法，其特征在于：包括以下步驟：

(1) 銅綠假單胞菌總DNA提取：取新培養的銅綠假單胞菌液200μL，5000×g離心5min收集菌，加入DNA快速提取液80μL，56℃水浴10min，98℃水浴2min，-20℃保存；

(2) 環介導等溫擴增反應體系為：1. 4M betaine , 200 μM dNTPs , 1×IsothermalAmplification Buffer Ⅱ, 8U Bst 3.0 DNA Polymerase , 2 μL模板 , FIP/BIP引物各1.6 μM , F3/B3引物各0.2μM , LF/LB引物各0.4μM , 顯色試劑1μL , ddH2O補齊至25μL；將上述所有試劑置于PCR 管中 , 65℃水浴40min擴增 , 80℃水浴10min終止反應；

(3) 環介導等溫擴增反應產物分析：若擴增產物變為藍綠色則為銅綠假單胞菌陽性，若擴增產物為黃褐色則為銅綠假單胞菌陰性。