[發明專利]一種環孢菌素H的分離純化方法

有效

• 申請號: 201711318491.4
• 申請日: 2017-12-12
• 公開（公告）號: CN108148118B
• 公開（公告）日: 2021-07-09
• 發明（設計）人: 陳秀明;樂占線;江莉
• 申請（專利權）人: 陳秀明
• 主分類號: C07K7/64
• 分類號: C07K7/64;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/16
• 代理公司: 福州市景弘專利代理事務所(普通合伙) 35219
• 代理人: 林祥翔;黃以琳

一種環孢菌素H的分離純化方法，其中層析柱采用了苯基氨基甲酸酯化β?環糊精硅膠作為層析柱的填料，進行環孢菌素H的分離純化，可將原料中的環孢菌素A和環孢菌素H進行有效分離。同時分離純化過程中，可使用單一極性溶劑，可對溶劑進行回收利用，節約生產成本。洗脫過程中，含有環孢菌素H的交叉部分還可以回收重新純化，避免造成浪費。同時，該技術方案適用于各種含環孢菌素H的原料,適用性強，可大量制備，可為醫藥工業提供大量高純度的環孢菌素H原材料。

技術領域

本發明涉及生物化學領域，特別涉及一種環孢菌素H的分離純化方法。

背景技術

環孢菌素(Cyclosporin)是20世紀70年代發現的由雪白白僵菌(Beauveriabassiana，原名為多孔木霉菌Tolypocladium inflatum)產生的一組環狀十一肽物質。其中的一個主要組分一環孢素A(Cyclosporin A,CsA)己作為高效免疫抑制劑廣泛應用于器官移植術，環孢素A結構圖與結構式可見圖1。它的問世引起了器官移植領域的一場革命。除免疫抑制作用外，環孢素還有一系列其它生物活性，如治療紅斑狼瘡、牛皮癬等自身免疫系統疾病，抑制HIV-1病毒，逆轉腫瘤多藥耐藥等。

環孢菌素H(Cyclosporin H,CsH)結構圖與結構式可見圖2，與CsA都是首先從半知菌屬多孔木霉(Tolypocladium inflatum后正名為雪白白僵菌Beauveria bassiana)代謝產物中分離出來的。CsH的化學結構和CsA相似，都是由十一個氨基酸組成的環狀多肽，只是第十一位上的甲基纈氨酸(MeVal)的構型不同，在CsA中為L構型，在CsH中為D構型。CsH無免疫抑制活性，但在逆轉腫瘤多藥耐藥、抗寄生蟲以及抗病毒方面與CsA有相似的作用，特別是在對G-蛋白偶聯受體(GPCR)－甲酰肽受體(FPR)功能的拮抗作用方面大大強于CsA，也強于許多其他甲酰肽受體拮抗劑，引起科學家廣泛的注意。此外，CsH已經用于研究其它的一些生物過程，包括程序性死亡、K+離子通道的功能性表達、Ca+在血管平滑肌可能的作用、一氧化氮(NO)合成酶活性、病毒誘導的細胞調亡、腫瘤和獲得性免疫缺陷綜合癥(HIV)等。

目前，環孢菌素H來源主要有兩個途徑：1、依據美國專利pat20120253007，Synthesis of Cyclosporin H的報道方法，將CsA轉換為CsH，但先分離出CsA，再進行CsH的轉換，步驟繁瑣，收率較低。2、從多孔木霉的發酵液經過濾或離心分離,濾液用乙酸丁酯提取,提取物除脂后得到環孢菌素的混合物,再經硅膠柱層析后經分部收集、去色素、減壓濃縮和干燥得到白色CsH粉末。圖3、圖4分別是由兩種發酵粗提取物環孢菌素H的HPLC圖，其中環孢菌素H含有不同比例，有2.7％也有4.1％(RT 79min)。從發酵粗提取物HPLC在210nm下可以看到含有的雜質大概分布情況，較難快速獲得高純度的環孢菌素H。其中，這兩種發酵粗提取物一般是經過不同的層析作為環孢菌素A的生產原料。但由于發酵副產物較多，提取步驟復雜，收率較低。圖5是由環孢菌素A合成制備的環孢菌素H的HPLP圖，其中環孢菌素H含量為21.4％。

目前獲得環孢菌素H的主要方法用硅膠或者ODS-C18色譜填料對以上環孢菌素粗品進行提純，但分離度效果不好、收率低且繁瑣。有研究報道，可采用大孔樹脂結合高速逆流色譜分離純化的方法，分離中交叉組分大，純化周期長，不適合放大。