[發明專利]低表達GFPT1的DU145穩定細胞株及構建與應用

有效

• 申請號: 201711314666.4
• 申請日: 2017-12-12
• 公開（公告）號: CN109913498B
• 公開（公告）日: 2022-08-02
• 發明（設計）人: 樸海龍;劉靜
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N5/10
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 馬馳

本發明公開一種新發現的可以對前列腺癌增殖產生影響的通路?GFPT1調控AMPK磷酸化的通路。具體采用shRNA干擾技術在DU145細胞中干涉GFPT1，以達到激活AMPK的活性，抑制細胞增殖的目的，經過結晶紫染色和蛋白免疫印跡實驗檢測證實，GFPT1的抑制能夠激活AMPK通路抑制細胞增殖，從而達到有效治療前列腺癌的目的。

技術領域

本發明涉及到細胞生物學與生物化學與分子生物學技術，具體涉及檢測細胞增殖及AMPK磷酸化的方法。

背景技術

腫瘤的發生發展常常與一系列能量產生機制的失衡相關。從正常細胞到腫瘤細胞的進化過程中,細胞必須面對各種各樣的脅迫,例如癌基因的激活、低氧條件、營養物質的缺乏及化學和放射治療。在壓力的刺激下腫瘤細胞通過調節細胞代謝以提供支持腫瘤生存和成長的營養。將細胞代謝和腫瘤聯系在一起最有代表性的分子之一是AMP活化的蛋白質激酶AMPK(AMP-activated protein kinase,AMPK)。

腫瘤代謝紊亂是腫瘤發生發展的重要特征，腫瘤的生長常常與一系列的能量產生機制的失衡相關，這種現象被稱為Warburg現象。即腫瘤細胞主要使用糖酵解及乳酸發酵產生能量，而不是通過三羧酸循環中丙酮酸的氧化磷酸化。葡萄糖是生物體內主要的營養物質,在被細胞攝入后就迅速的被磷酸化生成6-磷酸葡萄糖,進一步轉換成6-磷酸果糖。大部分的6-磷酸果糖通過糖酵解作用產生ATP，2％-5％的葡萄糖進入己糖胺信號通路(HBP)。與正常細胞相比腫瘤細胞葡萄糖的吸收及糖酵解明顯增加,導致了糖酵解中間途徑HBP和磷酸戊糖途徑(PPP)的增加。

GFPT1作為己糖胺合成中的第一個及限速酶,在癌癥中的作用這些年受到了越來越多的關注。通過數據庫分析，GFPT1在乳腺癌、前列腺、肺癌、膀胱癌、胰腺癌等許多惡性腫瘤中異常表達，證明GFPT1在腫瘤發生發展中具有重要作用。同時研究證實GFPT1高表達的三陰性乳腺癌患者的存活期及總生存數明顯下降。前列腺癌病人的組織中GFPT1表達量明顯升高,研究者認為GFPT1可作為前列腺癌的標簽蛋白。

發明內容

本發明涉及輔助治療前列腺癌的新通路，目的一是闡明GFPT1通過調節AMPK的磷酸化抑制腫瘤發生發展，目的二,為GFPT1在癌癥診斷、預后、治療、腫瘤標志物篩選等臨床轉化應用提供基礎。

實驗結果表明，GFPT1抑制了腫瘤細胞的生物合成，同時在2-DG處理條件下，GFPT1抑制了AMPK的磷酸化。包括如下步驟：

包裝細胞的轉染

1)轉染前一天將慢病毒包裝細胞293T接種于60mm細胞培養皿以使第二天細胞密度達到60％～70％。

2)在293T細胞中以1:8:9的比例轉染5μg包裝質粒及病毒質粒分別為pVSVg:PSPAX2:shRNA(包含shControl及shGFPT1片段)。

3)轉染8-12h后吸去培養基并加入3ml完全培養基。

4)轉染后72h，將上清放入15ml離心管中，3000轉離心10分鐘，吸取上清并用0.45μm的濾膜過濾，得到所需病毒(后續實驗凡是接觸過病毒液的吸管都要用84消毒液清洗)。

靶細胞感染與篩選

1)感染前24h將靶細胞DU145接種于35mm dish或六孔板中以使第二天細胞密度達到50％左右。

2)取1ml病毒液加入5μg/ml polybrene后加入到預感染的DU145/VCAP細胞中，并于37℃、5％CO2培養箱內培養。

3)感染的DU145細胞培養8h～24h后吸去培養基，換用完全培養基轉至10cm dish中，繼續培養。

4)24h后用含1.5μg/ml puromycin的培養基換液，等細胞長成后驗證目標基因的表達。