[發(fā)明專利]低表達GFPT1的DU145穩(wěn)定細胞株及構(gòu)建與應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201711314666.4
• 申請日: 2017-12-12
• 公開（公告）號: CN109913498B
• 公開（公告）日: 2022-08-02
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 樸海龍;劉靜
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N5/10
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 馬馳

1.一種DU145-shGFPT1穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系的應(yīng)用，其特征在于，將GFPT1的低表達調(diào)控AMPK的磷酸化；包括以下步驟：

1）將GFPT1低表達細胞（0.5-1.5）×10⁶細胞/皿的數(shù)量接種到培養(yǎng)皿中，

2）12-24小時后，在培養(yǎng)基 中加入終濃度10-50mM的2-DG即2-deoxy-D-glucose，繼續(xù)培養(yǎng)1-24小時，

3）吸走培養(yǎng)基，加入1-2 ml PBS洗去剩余培養(yǎng)基，吸走PBS，將細胞培養(yǎng)皿置于液氮中淬滅；

4）每個培養(yǎng)皿加入100-200 μl的RIPA裂解液，破碎細胞，提取蛋白；

5）對蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)印至0.22μm的PVDF膜上；

6）利用β-actin，AMPKα，ACC，p-ACC S79特異抗體，通過Western Blot進行化學發(fā)光；

所述DU145-shGFPT1穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系的構(gòu)建方法為：以前列腺癌DU145細胞作為宿主細胞，通過慢病毒感染導致細胞中GFPT1蛋白的表達量下調(diào)來抑制腫瘤細胞的生長。

2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述DU145-shGFPT1穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系的構(gòu)建包括以下步驟：

1) 用于慢病毒包裝的細胞293T接種于細胞培養(yǎng)皿60mm；

2) 在293T細胞中以1:8:9的質(zhì)量比例轉(zhuǎn)染5μg包裝質(zhì)粒及病毒質(zhì)粒，質(zhì)粒分別為pVSVg :PSPAX2 : shRNA，shRNA包含shControl及shGFPT1片段，shGFPT1片段1（sh1）的序列：GCTATGACTTCGAATCTGA；shGFPT1片段2（sh2）的序列：AGGCAAAGACAAGAAAGGA；

3) 轉(zhuǎn)染8-12h后吸去培養(yǎng)基并加入完全培養(yǎng)基；

4) 轉(zhuǎn)染后48-72h，將上清放入離心管中，3000-4000轉(zhuǎn)離心10-15分鐘，吸取上清并用0.45μm的濾膜過濾，得到所需病毒；

5) 感染前16-24h將靶細胞DU145/VCAP接種于細胞培養(yǎng)皿以使第二天細胞密度達到50%-60%，取1-2ml病毒液加入5-6μg/ml polybrene后加入到預感染的DU145/VCAP細胞中；

6) 感染的DU145/VCAP細胞培養(yǎng)8h~24h后吸去培養(yǎng)基，換用完全培養(yǎng)基轉(zhuǎn)至10cm dish中，繼續(xù)培養(yǎng)；

7) 用含1.5-2μg/ml puromycin的培養(yǎng)基換液對細胞進行篩選。

3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于：所述DU145-shGFPT1穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系的構(gòu)建還包括以下步驟：

8）通過免疫熒光及免疫共沉淀技術(shù)檢測GFPT1的感染效率及表達量的變化；

9) 十二孔板中接種3000個DU145低表達GFPT1細胞，在第3、5、7、9天取出細胞進行結(jié)晶紫染色，拍照后用冰醋酸洗滌細胞，用酶標儀讀取數(shù)值,繪制細胞的增殖曲線。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，通過干擾GFPT1來促進AMPK的磷酸化，能夠抑制前列腺癌細胞的增殖。