[發明專利]一種用于傷口愈合的干細胞分泌因子精華液的制備方法

在審

• 申請號: 201711313308.1
• 申請日: 2017-12-12
• 公開（公告）號: CN109908177A
• 公開（公告）日: 2019-06-21
• 發明（設計）人: 趙偉;占天焱;黃慶雷
• 申請（專利權）人: 北京弘潤天源基因生物技術有限公司
• 主分類號: A61K35/28
• 分類號: A61K35/28;A61K8/99;A61Q19/00;A61P17/02;C12N5/0775
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1.臍帶的選?。哼x取1根健康產婦正常分娩的臍帶組織，為孕婦自愿的前提下選取，2℃～8℃條件下保存。

2.分離臍帶組織：根據權利要求1中取得的臍帶組織，在24小時內將包含間充質部分的組織塊分離出來，過程如下：將臍帶組織置于百級超凈臺環境下的培養皿中，用PBS將組織表面的血跡沖洗干凈，將臍帶組織剪成小段，并將臍帶內血管去除，后將臍帶表面的羊膜組織也剝離開，剩余的部分用鑷子和手術刀分離開，得到含有間充質干細胞的組織塊。

3.組織塊的培養：將組織塊轉移到150mm的培養皿中，用18號手術刀片切割成1mm³左右的小塊，將小組織塊轉移到T175的培養瓶中，加入臍帶間充質干細胞專用培養基，37℃、5%CO₂培養箱中進行培養。

4.獲取P2代細胞：觀察臍帶間充質干細胞的生長狀態，當匯合度達到50%的時候將培養瓶中的組織塊取出，繼續培養，當匯合度達到90%左右的時候胰蛋白酶消化，獲取P1代細胞，P1代細胞轉移到T175的培養瓶中繼續培養，當匯合度達到90%左右的時候胰酶消化，獲得P2代細胞。

5.獲取干細胞培養上清原液：將P2代細胞以1×10⁴/cm²接種密度分別接種到5個T175的培養瓶中培養，37℃、5%CO₂培養箱中培養48小時，當P2代細胞生長匯合度達到85%-90%的時候，收取P2代細胞的培養上清原液，-20℃儲存備用。

6.獲取濃縮精華液：對權利要求5的上清液在3000rpm條件下離心10分鐘，留上清棄沉淀；然后通過100KD超濾膜，收集透析液，再將透析液通過3KD超濾膜，收集截留液，得到細胞因子濃縮精華液，經過濾器除菌過濾后，經安瓿瓶進行分裝。

7.傷口愈合因子濃度檢測：用ELISA方法檢測權利要求5中留取的上清原液樣品和權利要求6中留取的精華液樣品中白細胞介素 8（IL8），白細胞介素 6（IL6），轉化生長因子 1（TGF-β1），單核細胞趨化蛋白 1（MCP-1），血管內皮生長因子（VEGF），GM-CSF 和 TIMP-1 的濃度水平。

8.用于權利要求7中的臍帶間充質干細胞培養上清原液和濃縮液待檢樣品，在檢測前應恢復到室溫，避免反復凍融。

9.實驗以樣本稀釋液為空白對照，并作復孔檢測，檢測的整個過程要嚴格按照ELISA因子檢測試劑盒說明書進行檢測。

10.根據權利要求1-6所述的間充質干細胞因子精華液的制備方法，其特征在于，所述的臍帶組織來源的間充質干細胞是通過以下方式獲得的：（1）沖洗臍帶組織，優選的使用含有青霉素-鏈霉素的氯化鈉鹽緩沖液沖洗臍帶組織；（2）將臍帶組織切成小塊后，優選1mm³左右的小塊，平鋪于培養瓶底部，進行培養。

11.權利要求6中，選取的濃縮區間范圍是3KD-100KD之間，其中要收集和檢測的傷口愈合因子的分子量都在此范圍內，其分別是：白細胞介素 8（IL8）分子量為69-79KD；白細胞介素6（IL6）分子量為21-30KD；轉化生長因子 1（TGF-β1）分子量為44.3KD；單核細胞趨化蛋白1（MCP-1）分子量為8-10KD；血管內皮生長因子（VEGF）分子量為34-45KD；粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）分子量為18-22KD；基質金屬蛋白酶抑制劑1（TIMP-1）分子量為25.21KD。

12.權利要求7中所用的檢測試劑盒均為R&D System品牌的，先用試劑盒中的標準品測出各標準品的OD值，并制作標準曲線備用；樣品在檢測之前統一在冰箱中取出，恢復到室溫，每個樣品的每項檢測指標均嚴格按照使用說明進行實驗操作，將計算出的OD值根據各標準曲線換算成對應的濃度。