[發明專利]親和層析柱、制備方法及應用

有效

• 申請號: 201711312415.2
• 申請日: 2017-12-11
• 公開（公告）號: CN107855115B
• 公開（公告）日: 2020-06-02
• 發明（設計）人: 徐曉勇;宋秀麗;梅曉璐
• 申請（專利權）人: 杭州華安生物技術有限公司
• 主分類號: B01J20/24
• 分類號: B01J20/24;B01J20/291;B01J20/30;B01D15/38;C07K1/22;G01N27/447
• 代理公司: 北京超凡志成知識產權代理事務所(普通合伙) 11371
• 代理人: 李進

本發明涉及生物化學純化領域，具體而言，提供了一種親和層析柱、制備方法及應用。本發明提供的親和層析柱的制備方法，將抗原、還原劑與層析柱填料在層析柱空柱中進行孵育反應，得到反應柱，對反應柱進行洗滌，并對反應柱中多余的結合位點進行封閉處理，得到親和層析柱。該方法是通過還原劑將抗原中的二硫鍵打開形成自由巰基，抗原中的巰基與層析柱填料進行共價偶聯，通過一次性的緩沖液的洗滌即可保存或使用親和層析柱，不需要進行梯度洗滌的繁瑣步驟，節省人力物力，節約時間，該方法適用于各種抗原可用于工業化生產。本發明提供的親和層析柱，通過上述制備方法制備得到，性能穩定，成分均勻，可以重復使用，特異性好，可以廣泛應用于生產。

技術領域

本發明涉及生物化學純化技術領域，具體而言，涉及一種親和層析柱、制備方法及應用。

背景技術

現階段以重組蛋白作為抗原免疫制備抗體，后續要得到高純度的特異性抗體，都需要利用親和層析柱進行抗體的純化。目前市場上的親和層析柱主要有兩種：一種是將細菌的細胞壁蛋白protein A通過基因工程的手段改造后偶聯到瓊脂糖凝膠上(如商品化的protein A、protein G等填料)，利用該細胞壁蛋白具有與抗體IgG分子的Fc區特異性結合的結構域，從而將抗體純化下來。另外一種方法是利用蛋白的游離氨基與共價偶聯的配體預活化填料進行化學的共價偶聯，從而制作成抗原親和層析柱進行抗體的純化。

利用市場上的商品化填料(如protein A、protein G等)，在進行抗體親和純化時，雖然能達到抗體的富集的目的，仍存在以下缺點：

(1)純化得到目的抗體的同時，將免疫動物血清中自帶的免疫球蛋白也給純化下來，從而導致后續檢測背景的干擾。

(2)該方法對于特殊亞型的抗體，如IgA，IgE，IgY等都無法進行純化。

此外，利用蛋白的游離氨基進行共價固定偶聯到瓊脂糖凝膠上，雖然可以避免將免疫動物血清中自帶的免疫球蛋白也給純化下來，減少檢測背景的干擾，但是存在一定的局限性，其缺點如下：

(1)該方法需要偶聯的蛋白是可溶性的，否則無法進行有效的共價偶聯；而在實際的生產中，由于一些蛋白片段較大，通常是以包涵體的形式存在，即使后續經過變復性的處理，仍有很大一部分的蛋白是以沉淀形式存在。

(2)該方法在偶聯時，需要排除一些游離氨基酸及帶氨基的化學試劑的干擾，如重組蛋白變性常用的尿素等試劑。

有鑒于此，特提出本發明。

發明內容

本發明的第一目的在于提供一種親和層析柱的制備方法，以緩解現有技術中對偶聯抗原部分有要求，親和層析柱制備步驟復雜繁瑣、費時費力、成本較高的技術問題；

本發明的第二目的在于提供上述制備方法制備親和層析柱中的應用，以降低現有技術中制備親和層析柱的物料成本、時間成本和人力成本；

本發明的第三個目的在于提供上述制備方法制備得到的親和層析柱，以緩解現有技術中純化目標抗體時操作步驟繁瑣，費時費力的問題。

為了實現本發明的上述目的，特采用以下技術方案：

本發明提供了一種親和層析柱的制備方法，包括：將抗原、還原劑與層析柱填料在層析柱空柱中進行孵育反應，得到反應柱，對反應柱進行洗滌，并對反應柱中多余的結合位點進行封閉處理，得到親和層析柱。

進一步地，所述還原劑為二硫蘇糖醇、巰基乙醇或三(2-羧乙基)膦。

進一步地，所述層析柱填料可與巰基偶聯；

優選地，所述層析柱填料為瓊脂糖凝膠；

優選地，所述瓊脂糖凝膠為碘乙?；罨沫傊悄z或環氧基活化的瓊脂糖凝膠。

進一步地，所述抗原與還原劑的重量份數比為1-2:2。