[發明專利]一種莫勒菌的原生質體制備方法

有效

• 申請號: 201711312365.8
• 申請日: 2017-12-12
• 公開（公告）號: CN107904178B
• 公開（公告）日: 2021-06-01
• 發明（設計）人: 邱君志;睢珺文;薛青霖;牛亞靜;楊芳;謝勇嘯;陳宇熹;魏秀艷;涂新亞;姚靈丹
• 申請（專利權）人: 福建農林大學
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14;C12R1/645
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學俊

一種莫勒菌的原生質體的制備方法,接PDA菌體培養基上健壯菌絲體于PDB液體培養基中，在150rpm，28℃搖床培養36?54h,再將菌絲用四層無菌紗布過濾后，用無菌的研缽對菌絲進行研磨。將研磨好的菌絲放入PDB培養基中于100rpm，28℃搖床培養16h。再用四層無菌紗布過濾出菌絲，再用無菌藥匙將菌絲轉入無菌的三角瓶中，并用10mL 0?0.08%β?巰基乙醇預處理菌絲體30分鐘,采用20?26.6mg真菌溶壁酶（酶液pH5.6?6.2），在24?30℃酶解2.4?3.3h,用0.4?0.7mol/L某溶液做滲透壓穩定劑時,原生質體數量達到2.2?3.2×10⁷個/mL,再生率達15%?45%。

技術領域

本發明屬于生物工程中微生物育種的方法,特別涉及一種莫勒菌的原生質體制備方法。

背景技術

莫勒菌系蟲生真菌重要成員之一，是粉虱和介殼蟲的主要病原真菌，多發生于拉丁美洲和東南亞,我國南方部分省市柑桔區亦有流行。近年來，利用原生質體轉化技術把外源抗蟲基因轉入莫勒菌，有望增加該真菌的致病能力，縮短其作用時間，增強防效和穩定性。

本文從菌絲出發對莫勒菌原生質體的制備的關鍵因素進行了探索性研究，為利用原生質體高效遺傳轉化技術和原生質體融合技術培育多功能新型菌株奠定基礎。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是:提供一種莫勒菌的原生質體的制備方法,使其原生質體的制備率達到2.2-3.2×10⁷個/mL,再生率達15%-45%。

本發明的技術方案是:

（1）接PDA菌體培養基上健壯莫勒菌菌絲體于PDB液體培養基中，在150rpm，28℃搖床培養36-54h，再將菌絲用四層無菌紗布過濾后，用無菌的研缽對菌絲進行研磨，將研磨好的菌絲放入PDB培養基中于100rpm，28℃搖床培養16h；

（2）再用四層無菌紗布過濾出菌絲，再用無菌藥匙將菌絲轉入無菌的三角瓶中，并用10mL 0-0.08%β-巰基乙醇處理菌絲體30分鐘， 用pH5.6-6.2的磷酸鹽緩沖液配制0.4-1.0mol/L的NaCl、KCl、甘露醇或葡萄糖溶液，并用此溶液配制20-26.6mg/mL真菌溶壁酶，在24-30℃酶解2.4-3.3h，用0.4-0.7mol/LNaCl、KCl、甘露醇或葡萄糖溶液做滲透壓穩定劑，原生質體數量達到2.2-3.2×10⁷個/mL，再生率達15%-45%。

所述的莫勒菌的原生質體制備方法,最佳工藝參數是:

（1）接PDA菌體培養基上健壯莫勒菌菌絲體于PDB液體培養基中，在150rpm，28℃搖床培養54h,再將菌絲用四層無菌紗布過濾后，用無菌的研缽對菌絲進行研磨，將研磨好的菌絲放入PDB培養基中于100rpm，28℃搖床培養16h；

（2）再用四層無菌紗布過濾出菌絲，再用無菌藥匙將菌絲轉入無菌的三角瓶中，用10mL 0.01%β-巰基乙醇處理菌絲體30分鐘，用pH6.0的磷酸鹽緩沖液配制0.7mol/L的NaCl溶液，并用此溶液配制24.2mg/mL真菌溶壁酶，在30℃酶解2.7h，用0.7mol/L NaCl溶液做滲透壓穩定劑，原生質體數量達到3.2×10⁷個/mL,再生率達45%。

本發明效果是:

本莫勒菌的原生質體制備方法，

1．制備工藝簡單,易操作。

2．原生質體的制備率達到3.2×10⁷個/mL，再生率達45%。

具體實施方式

一種莫勒菌的原生質體制備方法提供了適合制備高莫勒菌原生質體數量的方法。