[發(fā)明專利]一株抗真菌鏈霉菌及其代謝物、代謝物制備方法與應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201711311108.2
• 申請日: 2017-12-11
• 公開（公告）號: CN108085273B
• 公開（公告）日: 2022-01-21
• 發(fā)明（設計）人: 周光雄;付書娜;王帆;林壁潤
• 申請（專利權）人: 暨南大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12P1/04;A61K35/74;A61P31/10;C12R1/48
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司 44245
• 代理人: 陳燕嫻

1.一株具有抗白色念珠菌活性的抗真菌鏈霉菌代謝產物的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)將發(fā)酵產物離心，獲得菌絲體和上清液；

(2)將所述的菌絲體用乙醇溶液浸泡12小時以上，過濾，浸提，將濾液合并減壓濃縮至無醇味，得到浸提物；

(3)浸提物用水溶解，再用石油醚、氯仿各萃取至少3次，取萃取液，減壓濃縮得到粗提物Ⅰ、粗提物Ⅱ；

(4)將粗提物Ⅱ加入溶劑溶解后進行凝膠柱層析進行分離，由極性由小到大進行梯度洗脫，每梯度洗脫體積為1.5L，流速為1mL/min，每75mL為一收集單位，取第8～20收集單位，即為餾分群S1 ；

(5)將餾分群S1 進行300～400目硅膠柱層析，丙酮溶解，用其重量比為2～3倍量的100～200目層析硅膠拌均，攤開待溶劑至盡，并將其加到樣品量20～30倍的300～400目層析硅膠柱上，并用石油醚/丙酮梯度系統(tǒng)，收集各流份，用硅膠板鑒定并合并具熒光斑點的流分，揮去溶劑，得無色針狀結晶，即為具有抗白色念珠菌活性的代謝產物；

步驟(4)中所述的梯度洗脫系統(tǒng)為體積比為1:4的正己烷/二氯甲烷，體積比為3:2的二氯甲烷/丙酮和體積比為1:4的二氯甲烷/丙酮；

步驟(5)中所述的代謝產物的結晶所用的試劑為體積比為10:1的石油醚/丙酮；

所述發(fā)酵產物的制備方法，包括如下步驟：

1)菌株的培養(yǎng)

使用改良的高氏一號培養(yǎng)基制備斜面培養(yǎng)，于28～30℃在斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)所述的鏈霉菌，直至菌絲和孢子生長成熟；所述的改良的高氏一號培養(yǎng)基，其具體組成如下：可溶性淀粉20g，KNO₃ 1g，K₂HPO₄ 0.5g，海水晶3g，FeSO₄ 0.01g，MgSO₄·7H₂O 0.05g，瓊脂15g，調pH7.2～7.4，水1000mL，于115～121℃滅菌30分鐘；

2)菌株的發(fā)酵

種子液的制備：將步驟1)斜面上的菌絲和孢子接種入發(fā)酵培養(yǎng)基，27～33℃下160～180rpm培養(yǎng)24～36h，得到所述的鏈霉菌種子液；再接種于發(fā)酵培養(yǎng)基上發(fā)酵：將所述的鏈霉菌種子液以體積百分比8～10％的接種量接至發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵，即得發(fā)酵產物；其中，發(fā)酵的具體步驟為：于27～33℃以300～400rpm的轉速、10～15L/min的空氣通量進行發(fā)酵110～130小時；

所述的發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：8.0％蔗糖，4.0％酵母粉，0.5％碳酸鈣，調pH 7.0～7.4，水定容至1000mL，于115～121℃滅菌30分鐘；

所述抗真菌鏈霉菌，命名為抗生 鏈霉菌（Streptomyces antibioticus ）2017-09，保藏編號為GDMCC No.60257，于2017年10月25日保藏在位于中國廣東廣州的廣東省微生物菌種保藏中心。

2.根據權利要求1所述的抗真菌鏈霉菌代謝產物的制備方法，其特征在于：

步驟(2)中所述的乙醇溶液為體積百分比為95％的乙醇溶液；

步驟(2)中所述的乙醇溶液的加入量為菌絲體體積的3～5倍。

3.一種具有抗白色念珠菌活性的代謝產物，其特征在于：

通過權利要求1中所述的抗真菌鏈霉菌代謝產物的制備方法制備得到。

4.根據權利要求3所述的具有抗白色念珠菌活性的代謝產物，其特征在于：所述的代謝產物為分子量范圍在400～600范圍的組分。

5.權利要求1中所述的鏈霉菌或權利要求3～4任一項所述的具有抗白色念珠菌活性的代謝產物的應用，其特征在于：所述的應用為在制備治療真菌感染疾病藥物中的應用；所述的真菌為白色念珠菌。