[發明專利]cfDNA捕獲建庫方法

在審

• 申請號: 201711310114.6
• 申請日: 2017-12-11
• 公開（公告）號: CN108070910A
• 公開（公告）日: 2018-05-25
• 發明（設計）人: 趙新泰;王明;潘文健
• 申請（專利權）人: 上海賽安生物醫藥科技股份有限公司
• 主分類號: C40B50/06
• 分類號: C40B50/06;C12Q1/686
• 代理公司: 上海海頌知識產權代理事務所(普通合伙) 31258
• 代理人: 任益

本發明涉及一種cfDNA捕獲建庫方法，包括以下步驟：A.制作接頭，對接頭進行退火反應，純化；B.對樣本DNA進行處理，進行末端補齊反應；C.末端補齊的DNA片段進行加A反應；D.加A反應后的產物與接頭進行連接反應；E.連接反應的產物采用探針組和單條引物對進行捕獲延伸；F.捕獲延伸后的產物采用上游引物和下游引物進行擴增得到文庫。本發明的cfDNA捕獲建庫方法能夠實現高靈敏度、快速、低成本的二代文庫構建。

技術領域

本發明涉及一種基于Ion Torrent二代測序平臺的DNA捕獲建庫方法，屬于生物技術領域。

背景技術

新一代高通量基因檢測技術，當今主要以Illumina公司的Hiseq，Miseq系列和Life公司的Ion TorrentTM系列測序儀為代表，有著其他技術不可比擬的高通量、低成本等優勢。已被廣泛用于各類生物學研究和醫學檢測。

目前腫瘤的發病率和死亡率高于其他疾病，針對腫瘤病人的治療首選靶向治療。由于腫瘤發病機制復雜，腫瘤細胞存在異質性，因此，同種癌種適合的靶向藥會有所不同。針對同種癌種不同治，同一個病人不同時期不同治的要求，在用藥前對病人進行靶點的全面篩查成為必要。

高通量測序技術使更全面更精準的篩選用藥靶點成功實現。二代測序技術中的靶向測序同樣具有巨大優勢，由于測序的區域小，可以對某些區域進行深度測序，使得低頻突變的檢測率大大提高。腫瘤關鍵基因較多，適合使用二代測序對某些關鍵的基因進行深度測序，得到腫瘤致病突變信息及相關用藥靶點信息。然而，傳統靶點篩查需要取到病灶組織，這極大的限制了高通量測序技術在該領域的應用。開發以非侵入式診斷策略進行腫瘤基因診斷，成為新的需求，其中，最為突出的是對病人cfDNA進行檢測是當前最具潛力的途徑。由于cfDNA中所含來自腫瘤細胞的ctDNA往往使極微量的，因此，對檢測靈敏度和準確度均提出了新的更高的要求。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種能夠實現高靈敏度、快速、低成本的二代文庫構建的cfDNA捕獲建庫方法。

本發明為解決上述技術問題提出的一種技術方案是：一種cfDNA捕獲建庫方法，包括以下步驟：

A.制作接頭，對接頭進行退火反應，純化；

B.對樣本DNA進行處理，進行末端補齊反應；

C.末端補齊的DNA片段進行加A反應；

D.加A反應后的產物與接頭進行連接反應；

E.連接反應的產物采用探針組和單條引物對進行捕獲延伸；

F.捕獲延伸后的產物進行PCR擴增得到文庫。

上述接頭是雙鏈接頭，由單鏈a和單鏈b組成，所述單鏈b包括從3’端至5’端依次設置的互補序列區域、任意堿基序列區域、樣本barcode區域和Ion接頭A部分的序列；所述互補序列區域中包括與單鏈a的序列反向互補的序列。

上述單鏈a序列的堿基個數為13～16個；所述互補序列區域的堿基個數為17～20個；所述任意堿基序列區域是12個隨機堿基；所述樣本barcode區域的堿基個數為6個；所述Ion接頭A部分的堿基個數為30～35個。

上述單鏈a的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述單鏈b的核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示。

上述單鏈a的5’端設有磷酸化修飾；所述單鏈b的5’端的至少三個堿基上設有硫代磷修飾。