[發明專利]cfDNA捕獲建庫方法

在審

• 申請號: 201711310114.6
• 申請日: 2017-12-11
• 公開（公告）號: CN108070910A
• 公開（公告）日: 2018-05-25
• 發明（設計）人: 趙新泰;王明;潘文健
• 申請（專利權）人: 上海賽安生物醫藥科技股份有限公司
• 主分類號: C40B50/06
• 分類號: C40B50/06;C12Q1/686
• 代理公司: 上海海頌知識產權代理事務所(普通合伙) 31258
• 代理人: 任益

1.一種cfDNA捕獲建庫方法，不用于疾病的診斷和治療，其特征在于，包括以下步驟：

A．制作接頭，對接頭進行退火反應，純化；

B．對樣本DNA進行處理，進行末端補齊反應；

C．末端補齊的DNA片段進行加A反應；

D．加A反應后的產物與接頭進行連接反應；

E．連接反應的產物采用探針組和單條引物對進行捕獲延伸；

F．捕獲延伸后的產物進行PCR擴增得到文庫。

2.根據權利要求1所述的cfDNA捕獲建庫方法，其特征在于：所述接頭是雙鏈線形接頭，由單鏈a和單鏈b組成，所述單鏈b包括從3’端至5’端依次設置的互補序列區域、任意堿基序列區域、樣本barcode區域和Ion接頭A部分的序列；所述互補序列區域中包括與單鏈a的序列反向互補的序列。

3.根據權利要求2所述的cfDNA捕獲建庫方法，其特征在于：所述單鏈a序列的堿基個數為13～16個；所述互補序列區域的堿基個數為17～20個；所述任意堿基序列區域是12個隨機堿基；所述樣本barcode區域的堿基個數為6個；所述Ion接頭A部分的堿基個數為30～35個。

4.根據權利要求3所述的cfDNA捕獲建庫方法，其特征在于：所述單鏈a的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述單鏈b的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

5.根據權利要求4所述的cfDNA捕獲建庫方法，其特征在于：所述單鏈a的5’端設有磷酸化修飾；所述單鏈b的5’端的至少三個堿基上設有硫代磷修飾。

6.根據權利要求4所述的cfDNA捕獲建庫方法，其特征在于：所述步驟E中，所述探針組包括15個探針，分別是核苷酸序列如SEQ ID No.3所示的探針a，核苷酸序列如SEQ ID No.4所示的探針b，核苷酸序列如SEQ ID No.5所示的探針c，核苷酸序列如SEQ ID No.6所示的探針d，核苷酸序列如SEQ ID No.7所示的探針e，核苷酸序列如SEQ ID No.8所示的探針f，核苷酸序列如SEQ ID No.9所示的探針g，核苷酸序列如SEQ ID No.10所示的探針h，核苷酸序列如SEQ ID No.11所示的探針i，核苷酸序列如SEQ ID No.12所示的探針j，核苷酸序列如SEQ ID No.13所示的探針k，核苷酸序列如SEQ ID No.14所示的探針l，核苷酸序列如SEQID No.15所示的探針m，核苷酸序列如SEQ ID No.16所示的探針n，核苷酸序列如SEQ IDNo.17所示的探針o。

7.根據權利要求6所述的cfDNA捕獲建庫方法，其特征在于：所述步驟E中的反應體系中包括連接反應的產物19體積，探針組溶液2體積，單條引物溶液2體積，緩沖液3體積，dNTP溶液3體積，熱啟動酶0.3體積，純水補足30體積；所述探針組中的各個探針在反應體系中的最終濃度均為1μM，所述單條引物在反應體系中的最終濃度為10μM。

8.根據權利要求7所述的cfDNA捕獲建庫方法，其特征在于：所述步驟E的反應條件是步驟一，在98℃，30min；步驟二，在98℃，20s，在65℃，15s，在72℃，30s，重復步驟二8次；步驟三，在72℃，5min；步驟四，保持在10℃。

9.根據權利要求6所述的cfDNA捕獲建庫方法，其特征在于：所述步驟E中，所述單條引物的核苷酸序列如SEQ ID No.18所示。

10.根據權利要求6所述的cfDNA捕獲建庫方法，其特征在于：所述步驟F中采用上游引物和下游引物進行PCR擴增，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.19所示，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.20所示；所述上下游引物在反應體系中的最終濃度均為10μM。