[發明專利]一種稻米淀粉粒斷面的制備及觀察分析方法

有效

• 申請號: 201711306279.6
• 申請日: 2017-12-11
• 公開（公告）號: CN108107065B
• 公開（公告）日: 2019-11-01
• 發明（設計）人: 劉巧泉;張昌泉;陸彥;李錢峰;張曉敏
• 申請（專利權）人: 揚州大學
• 主分類號: G01N23/2202
• 分類號: G01N23/2202;G01N23/2251
• 代理公司: 南京知識律師事務所 32207
• 代理人: 盧亞麗

本發明公開了一種稻米淀粉粒斷面的制備及觀察分析方法，主要針對暗胚乳和糯稻稻米橫斷面中淀粉粒中間孔洞的觀察。該方法是選擇暗胚乳和糯稻稻谷；手動剝殼獲得糙米或者選擇機械脫殼、出精后無明顯裂紋的精米，并用干冰?液氮混合物速凍；迅速斷裂；修塊并固定在載物臺上觀察和分析。本發明方法的優點是操作簡單、快速和成本低廉，能夠有效的對單個淀粉粒進行斷裂從而觀察到單個淀粉粒內部的結構，克服了常規稻米斷裂方法無法斷開淀粉粒的缺陷，為稻米外觀分析尤其是稻米透明度的研究提供了重要技術支持，對稻米外觀品質改良研究具有重要意義。

技術領域

本發明涉及生物材料的掃描電子顯微鏡觀察技術領域，特別是涉及水稻暗胚乳和糯稻稻米淀粉粒斷面孔觀察的樣品制備及分析方法。

背景技術

稻米透明度是目前育種家和廣大消費者關心的重要性狀，也是優質稻米定級的一個重要指標。一般常規的粳稻和秈稻稻米在透明度評價中都能夠達到優質稻米的要求，然而對于近年來大量上市的軟米而言，由于其直鏈淀粉含量普遍較低，在水分含量較低的情況下稻米的透明度會極顯著下降而往往達不到優質稻米標準。稻米中的主要成分是淀粉，后者包括直鏈淀粉和支鏈淀粉，其中直鏈淀粉的含量對稻米的透明度影響非常大，尤其是在含量比較低的時候會造成暗胚乳表型，不含直鏈淀粉的稻米表現為糯稻表型。在遺傳研究方面已經非常明確Wx基因的不同等位變異是造成稻米直鏈淀粉含量改變的直接原因，但是對于稻米透明度尤其是暗胚乳和糯稻的較差透明度形成的淀粉結構基礎目前并不明確。

稻米胚乳中淀粉粒的結構觀察是目前研究各種水稻胚乳突變體的重要方式，一般認為稻米灌漿不充實和高堊白的稻米胚乳中存在明顯的區域性的松散排列淀粉粒，并且由于松散排列淀粉粒間空腔對光線的折射而造成了堊白區的不透明表型。但暗胚乳和糯稻盡管透明度低或不透明，其胚乳淀粉粒仍排列緊密，無法用淀粉粒排列松散來解釋。由于通過常規的稻米制樣和掃描電子顯微鏡觀察只能觀察到稻米橫斷面中完整淀粉粒的結構和彼此間的排列方式，對于單個淀粉粒中間的結構(是否存在空腔)觀察由于缺乏有效的斷開單個淀粉粒的方法而難以完成淀粉粒內部結構的觀察。盡管有研究表明可以通過激光共聚焦顯微鏡的光學切片功能對淀粉粒內部進行觀察，但由于在觀察之前需要對樣品進行淀粉粒進行分離，處理過程復雜且有可能會對淀粉粒結構產生影響，另一方面，由于稻米淀粉粒非常小，激光共聚焦顯微鏡無法完成淀粉粒的精細分析。因此亟需通過對現有用于掃描電子顯微鏡分析的樣品制備方法進行改進，發明一種稻米淀粉粒斷面的制備及分析方法，為研究稻米透明度的成因以及在稻米淀粉結構研究方面提供技術支持。

發明內容

為克服當下稻米胚乳中淀粉粒內部結構無法分析的不足，本發明提供一種稻米淀粉粒斷面的制備及分析方法。

本發明所采用的技術方案如下：

一種稻米淀粉粒斷面的制備及觀察分析方法，是選擇暗胚乳和糯稻稻谷；剝殼獲得糙米或出糙獲得精米并用干冰-液氮混合物速凍；迅速斷裂；修塊并固定在載物臺上觀察和分析。

具體步驟如下：

(1)樣品選擇和準備：選擇自然干燥或烘干的暗胚乳和糯稻稻谷，手動剝殼獲得糙米或者選擇機械脫殼、出精后無明顯裂紋的精米；每個樣品的數量可根據需要確定；

(2)樣品斷裂：用鑷子夾住每粒樣品置于干冰-液氮混合物中速凍1-2分鐘，取出后迅速用尖頭鋼絲鉗固定籽粒一端，另一端用鑷子用力掰斷。選擇斷面平整的進行后續試驗；

(3)修塊：選取斷面平整的一半稻米，用鑷子固定帶有斷面的一段，用刀片切除斷面相對的一部分，并修整切口，使切口平整且與米粒保持垂直。修整后的斷面厚度保留2-3mm，并且用記號筆在修整的斷面上點一個點計作粘貼面，選擇3粒切口平整的小塊用于后續試驗；

(4)樣品固定：用鑷子將修整后的樣品塊有黑點的斷面朝下粘在樣品臺上的導電膠上，確保樣品垂直放置且整個操作過程不能用手觸碰上斷面，每個樣品固定3個小塊；