[發明專利]重組乙肝表面抗原的生產方法

有效

• 申請號: 201711305656.4
• 申請日: 2017-12-11
• 公開（公告）號: CN108330145B
• 公開（公告）日: 2021-06-11
• 發明（設計）人: 李建強;任蘇林;孫洪林;周童;顧月;葛君;戚鳳春;鮑夢汝;韓杰;陳曉曉
• 申請（專利權）人: 遠大賽威信生命科學（南京）有限公司
• 主分類號: C12N15/81
• 分類號: C12N15/81;C12P21/02;C07K14/02;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/18;C07K1/16;C12R1/78
• 代理公司: 北京泛華偉業知識產權代理有限公司 11280
• 代理人: 李渤;郭廣迅

本發明涉及一種重組乙肝表面抗原的生產方法，該方法獲得的菌株經過雙向加壓篩選，拷貝數高、遺傳穩定；通過甲醇濃度控制，高密度發酵過程穩定且表達量高。發酵后酵母細胞僅需要破碎、澄清、硅膠吸附、離子交換、超濾濃縮、密度梯度離心和分子篩層析，即可獲得高純度、高回收率的重組乙肝表面抗原，具有工藝周期短、抗原純度高、抗原顆粒均一等特點。

技術領域

本發明屬于蛋白藥物生產領域，具體涉及一種重組乙肝表面抗原的生產方法。

背景技術

據世界衛生組織報道，全球約20億人感染HBV，每年約有65萬人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和肝癌。20億感染者中，約2.4億人為慢性HBV感染，中國約占1/3(引自《世界衛生組織乙肝預防治療指南》2015年版)。目前尚無特效藥物用于治療乙肝和HBV攜帶者，研制并應用乙肝疫苗來預防乙肝和治療HBV攜帶者及乙肝病人有著重大意義。由于存在攜帶HIV等病毒及產量有限等問題，第一代血源性乙肝疫苗采用無癥狀乙肝病毒攜帶者血漿為原料，已經被世界衛生組織取締，取而代之的是重組乙肝疫苗。目前在國內外流通的重組乙肝疫苗主要由中華地鼠卵巢細胞(CHO)、釀酒酵母菌、畢赤酵母菌及漢遜酵母菌作為生產宿主細胞生產。由于酵母菌來源的細胞具有高表達量、低成本等優勢，目前在疫苗市場上已取得主導地位。

與釀酒酵母菌相比，甲醇營養型的漢遜酵母表現出更高的表達量，沒有過度糖基化的現象，并且能夠耐受高溫，最佳生長溫度為37℃-43℃(Reinders et al.1999)。外源基因的整合多為非同源重組整合(約占50％～80％)，但在質粒載體轉化漢遜酵母菌的早期，質粒載體以附加體(episome)的形式存在，且拷貝數較低(Gellissen et al.2000)。必要的加壓篩選步驟既能夠增加拷貝數，又能增加質粒載體整合進入基因組的穩定性，更容易篩選到高拷貝、高蛋白表達菌株，且遺傳穩定性更高。

在漢遜酵母發酵過程中，甲醇代謝第一步的酶為甲醇氧化酶(Methanoloxidase)，其編碼基因為MOX，該基因的缺失會造成甲醇氧化酶減少，甲醇利用率下降。目前，表達載體中的MOX啟動子和終止子序列多來源于漢遜酵母，序列相似度較高時容易造成同源重組替換掉MOX基因，從而抑制了菌體生長和外源蛋白表達。

漢遜酵母能夠用廉價的培養基進行高密度發酵，因此適于大規模發酵生產目的蛋白，能以甲醇為唯一碳源和能源的培養基中生長，甲醇代謝途徑的關鍵酶MOX、FMD和DHAS的表達受阻遏/解阻遏機制的調控(Gellissen et al.2000)。高濃度的葡萄糖和甘油阻遏能夠阻遏基因表達，甲醇、低濃度的甘油(0.3％)和葡萄糖(0.1％)能解阻遏。但過高的甲醇濃度也會導致反饋抑制，抑制外源蛋白的表達，發酵過程中的甲醇濃度準確控制，既能夠增加外源蛋白的表達，同時能夠增加工業生產過程中的批次間穩定性。

現有的各種酵母來源的重組乙肝表面抗原均屬于胞內表達，生產廠家的純化工藝各有不同，主流純化工藝中包括疏水層析等步驟，其主要原理是利用乙肝表面抗原富含脂質，疏水性質強的特點，但抗原在與層析填料吸附/解吸附的過程中可能會造成一定程度的VLP結構改變，導致純化工藝不穩定，收率偏低。

發明內容

本發明的一個目的是克服現有技術中已知的重組乙肝表面抗原的生產缺陷，提供一種高密度發酵重組乙肝表面抗原的方法，該方法包括如下步驟：

i)篩選乙肝表面抗原高拷貝、高蛋白表達的重組漢遜酵母菌株，包括以下步驟：

1)構建用于表達重組乙肝表面抗原的載體，表面抗原氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；優選地，表面抗原的編碼核酸序列如SEQ ID NO:2所示；

2)將步驟1)構建的載體轉化入URA3營養缺陷型漢遜酵母菌株中，并在質粒轉化的早期使用URA3基因突變互補和G418抗生素進行雙向加壓篩選，能夠提高外源基因拷貝數和基因組整合穩定性，更容易篩選到高拷貝、高蛋白表達菌株，且遺傳穩定性更更高；

ii)高密度發酵生產重組乙肝表面抗原，包括如下步驟：