[發明專利]重組乙肝表面抗原的生產方法

有效

• 申請號: 201711305656.4
• 申請日: 2017-12-11
• 公開（公告）號: CN108330145B
• 公開（公告）日: 2021-06-11
• 發明（設計）人: 李建強;任蘇林;孫洪林;周童;顧月;葛君;戚鳳春;鮑夢汝;韓杰;陳曉曉
• 申請（專利權）人: 遠大賽威信生命科學（南京）有限公司
• 主分類號: C12N15/81
• 分類號: C12N15/81;C12P21/02;C07K14/02;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/18;C07K1/16;C12R1/78
• 代理公司: 北京泛華偉業知識產權代理有限公司 11280
• 代理人: 李渤;郭廣迅

1.一種重組乙肝表面抗原的生產方法，該方法包括如下步驟：

i)篩選乙肝表面抗原高拷貝、高蛋白表達的重組漢遜酵母菌株，包括以下步驟：

1)構建用于表達重組乙肝表面抗原的載體；所述載體包含MOX啟動子-外源基因-AOX終止子表達框；

2)將步驟1）構建的載體轉化入URA3營養缺陷型漢遜酵母菌株中，并在質粒轉化的早期使用URA3基因突變互補和G418抗生素進行雙向加壓篩選；

ii)高密度發酵生產重組乙肝表面抗原，包括如下步驟：

1)甘油流加階段，控制甘油流加速率在2 g/min~10 g/min；

2)甲醇誘導階段，通過甲醇電極將甲醇濃度控制在4.5 g/L~8.5 g/L范圍內波動；

3)甲醇誘導時間控制在40-60小時，收集漢遜酵母細胞，得到重組乙肝表面抗原。

2.根據權利要求1所述的方法，其中，在所述甘油流加階段之前還包甘油初培養階段，所述甘油初培養階段使用BSM無機鹽培養基，調整pH至5.0，溫度37℃，通氣量15.0~35.0 L/min，控制溶氧在40%以上，罐壓保持在0.5 bar左右；所述BSM無機鹽包含: 0.90 g/LCaSO₄·2H₂O、11.67 g/L MgSO₄·7H₂O、14.67 g/L K₂SO₄、9.00 g/L (NH₄)₂SO₄、50 g/L甘油和25.05 g/L六偏磷酸鈉。

3.根據權利要求2所述的方法，其中，在所述甘油初培養階段之前還包括將所述重組漢遜酵母菌株制成種子液的步驟。

4.根據權利要求1所述的方法，其中，在所述甘油流加階段中，當溶氧快速上升時，開始補加甘油，甘油流加速率為2.0 g/min~10.0 g/min，當濕菌重升至250~300 g/L，停止甘油流加，待溶氧再次快速上升時，饑餓半小時后，開始甲醇誘導。

5.根據權利要求1所述的方法，其中，在所述甲醇誘導階段中，調整pH至5.0，溫度30℃，通氣量15.0~35.0 L/min，控制溶氧在20%以上，罐壓保持在0.5 bar左右，甲醇濃度控制在4.5 g/L~8.5 g/L。

6.根據權利要求5所述的方法，其中，所述甲醇濃度在4.5-8.3 g/L范圍內波動。

7.根據權利要求6所述的方法，其中，所述甲醇濃度在4.6-5.8 g/L范圍內波動。

8.根據權利要求6所述的方法，其中，所述甲醇濃度在5.0-6.5 g/L范圍內波動。