[發明專利]調節性T細胞體外擴增方法

在審

• 申請號: 201711305029.0
• 申請日: 2017-12-11
• 公開（公告）號: CN108060129A
• 公開（公告）日: 2018-05-22
• 發明（設計）人: 盧爽;鄭勇;李競;陳智勝
• 申請（專利權）人: 上海藥明生物技術有限公司
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783
• 代理公司: 上海浦一知識產權代理有限公司 31211
• 代理人: 鄭權

本發明公開一種調節性T細胞體外擴增方法，主要包括：分離，從血液樣品中先分離出CD4+CD127low T細胞，再從CD4+CD127low T細胞中分離出CD4+CD25+CD127low Treg細胞；激活細胞，將分離出的CD4+CD25+CD127low Treg細胞懸浮于培養基RPMI1640+10％FBS中，加入3?8倍細胞數量的CD3/CD28MACS磁珠，將細胞放于培養板中并加入500U/mL人重組IL?2，培養；擴增與培養細胞，細胞中加入500U/ml人重組IL?2，繼續培養；然后將細胞傳代，繼續加入500U/ml人重組IL?2培養；收集所有細胞，離心去除培養基，將細胞與細胞培養基加入到6孔板中培養2?3天；之后再次離心，將細胞與細胞培養基加入到細胞培養瓶中進行培養，每2?3天換液一次，從細胞激活開始總共培養14?22天，收集所有細胞。本發明的方法能夠有效促進調節性T細胞的增殖，并確保擴增后調節性T細胞的純度和功能。

技術領域

本發明涉及生物技術中的細胞培養技術領域，具體涉及一種調節性T細胞體外分選擴增方法及其使用。

背景技術

調節性T細胞(Treg)是一類控制體內自身免疫反應性的T細胞亞群，能夠抑制免疫反應的細胞群，在免疫病理、移植物耐受、阻止自身免疫反應和維持機體免疫平衡方面發揮重要的作用。雖然在外周血細胞所占的比例低，僅占正常人外周血、脾臟組織CD4+T細胞的5％～10％，但是與腫瘤、自身免疫病、移植物的接受性等有密切的關系。

近年來，癌癥免疫治療的臨床應用取得了顯著進展，已經成為繼手術、放療、化療、靶向治療后癌癥的另一有效治療手段。在各種免疫治療方式中，免疫檢查點療法是近幾年獲得突出療效的治療方法。免疫檢查點是一類免疫抑制性的分子，可以調節免疫反應的強度和廣度，從而避免正常組織的損傷和破壞，在腫瘤的發生、發展過程中，免疫檢查點成為免疫耐受的主要原因之一。免疫檢查點療法就是通過共抑制或共刺激信號等一系列途徑以調節T細胞活性來提高抗腫瘤免疫反應的治療方法。許多免疫檢查點分子在調節性T細胞上都有表達，例如CTLA-4，PD-1等。然而體內存在的調節性T細胞數量很少，僅占正常人外周血淋巴細胞的1-2％，體外獲取后數量少，純度不高，且細胞增殖能力低。因此，探索體外誘導和擴增高純度調節性T細胞，建立更有效的細胞增殖培養方法，并在短期內獲得有功能的調節性T細胞，是順利開展免疫檢查點與共刺激信分子抗體藥物體外功能實驗的重要前提。

正常人外周血中存在的調節性T細胞數量僅占CD4+T細胞的5-10％，并且傳統的CD25+CD4+Treg分離方法不但獲取細胞數量少，而且純度低，尤其是體外擴增過程中真正起抑制作用的Treg并沒有得到有效擴增，以至于最終獲得的細胞中Treg數量非常少，無法順利進展后續的體外功能實驗。而如何選擇合適的分選標志物，加入哪些激活物與細胞因子來促進Treg細胞增殖，確保擴增后細胞的純度和功能，是目前急待解決的問題。

發明內容

本發明所要解決的技術問題在于，提供一種調節性T細胞體外擴增方法，能夠有效促進調節性T細胞的增殖，并確保擴增后調節性T細胞的純度和功能。

為解決上述技術問題，本發明提供的調節性T細胞體外擴增方法，包括步驟：