[發明專利]調節性T細胞體外擴增方法

在審

• 申請號: 201711305029.0
• 申請日: 2017-12-11
• 公開（公告）號: CN108060129A
• 公開（公告）日: 2018-05-22
• 發明（設計）人: 盧爽;鄭勇;李競;陳智勝
• 申請（專利權）人: 上海藥明生物技術有限公司
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783
• 代理公司: 上海浦一知識產權代理有限公司 31211
• 代理人: 鄭權

1.一種調節性T細胞體外擴增方法，其特征在于，包括以下步驟：

第一步：分離，從血液樣品中直接分離出CD4+CD127low T細胞，再從CD4+CD127low T細胞中分離出CD25+T細胞，即獲得CD4+CD25+CD127low Treg細胞；

第二步：激活細胞，將分離出的CD4+CD25+CD127low Treg細胞懸浮于培養基RPMI1640+10％FBS中，加入3-8倍細胞數量的CD3/CD28MACS磁珠，將細胞按照每孔0.5～1×105放于培養板中，并加入終濃度500U/mL人重組IL-2，置于細胞培養箱培養12-20小時；

第三步：擴增與培養細胞，在第二步的細胞中加入終濃度500U/ml人重組IL-2，混合均勻，繼續放入細胞培養箱中培養2-3天；然后按照培養板每孔1×105將細胞傳代，繼續加入終濃度500U/ml人重組IL-2，培養2-3天；收集所有細胞，離心去除培養基，將細胞與混有500U/ml人重組IL-2的細胞培養基PRMI1640+10％FBS加入到6孔板中，培養2-3天；之后再次離心去除培養基，將細胞與混有500U/ml人重組IL-2的細胞培養基PRMI1640+10％FBS加入到細胞培養瓶中進行培養，每2-3天使用相同組分的細胞培養基換液一次，直至從細胞激活開始總共培養14-22天，之后收集所有細胞。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一步中，使用磁珠分選試劑盒分離出CD4+CD127low T細胞以及CD4+CD25+CD127low Treg細胞。

3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二步中，加入5倍于細胞數量的CD3/CD28磁珠，培養板中每孔為1×105個細胞。

4.如權利要求3所述的方法，其特征在于，所述第二步中，培養板為U型96孔細胞培養板，細胞培養箱的培養條件為37℃、5％CO2培養。

5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述第三步中，細胞培養瓶為T25細胞培養瓶。

6.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述第三步之后，取收集的部分細胞，使用流式細胞術檢測細胞表型。

7.如權利要求6所述的方法，其特征在于，所述流式細胞術檢測細胞表型的具體方法是，采用流式細胞術，使用anti-CD25、anti-CD127檢測細胞表面CD25與CD127分子，使用anti-Foxp3檢測細胞內Foxp3分子表達。

8.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述第三步之后，取收集的部分細胞，用于體外混合淋巴反應實驗鑒定其調節性T細胞的功能。