[發明專利]一種定量檢測豬瘟病毒抗體的磁微粒熒光免疫試劑盒

在審

• 申請號: 201711297715.8
• 申請日: 2017-12-08
• 公開（公告）號: CN108152509A
• 公開（公告）日: 2018-06-12
• 發明（設計）人: 李根平
• 申請（專利權）人: 廣州源起健康科技有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/543;G01N33/531
• 代理公司: 廣州市深研專利事務所 44229
• 代理人: 姜若天

1.一種定量檢測豬瘟病毒抗體的磁微粒熒光免疫試劑盒，其特征在于由豬瘟E2抗原免疫磁珠、熒光物質標記羊抗豬抗體、洗滌液、增強液、陰性對照血清和陽性對照血清組成。

2.如權利要求1所述的磁微粒熒光免疫試劑盒，其特征在于，所述免疫磁珠為帶有官能團修飾的直徑1~3μm的超順磁珠與蛋白的共價偶聯物，其中所使用的磁珠為羧基磁珠、氨基磁珠、羥基磁珠、甲苯磺酰基磁珠、NHS磁珠、鏈酶親和素磁珠、蛋白A磁珠、蛋白G磁珠、抗小鼠IgG磁珠、親水磁珠、疏水磁珠中的一種或幾種；所述的E2抗原為PK-15豬腎細胞表達的。

3.如權利要求1所述的磁微粒熒光免疫試劑盒，其特征在于，所述的熒光物質為鑭系鰲合物，為銪、釤、鋱或鏑的螯合物或其組合。

4.如權利要求1所述的磁微粒熒光免疫試劑盒，其特征在于，所述豬瘟E2抗原的制備方法為：按照GenBank上公布的CSFV 弱毒株基因序列設計一對引物，用于擴增E2 基因；將擴增好的豬瘟病毒E2基因通過clonExpress技術連入真核表達載體pEGFP-C1載體，轉化DH5α感受態細胞，在LB平板上挑取單克隆提取質粒，進行測序鑒定；將上述重組質粒pEGFP-E2通過DEAE-葡聚糖法轉染豬腎上皮細胞PK-15；培養后，高壓破碎細胞，將細胞上清進行親和層析純化并鑒定，獲得豬瘟病毒E2蛋白。

5.如權利要求1所述的磁微粒熒光免疫試劑盒，其特征在于，所述免疫磁珠的制備方法為：吸取羧基磁珠到離心管中，將離心管放置在磁力架中，利用磁力架進行磁珠和緩沖液的分離，用0.1M pH5.0的2-（N-嗎啡啉）乙磺酸洗滌磁珠3~5次；向上述洗滌好的磁珠中加入0.1M pH5.0的2-（N-嗎啡啉）乙磺酸，加入10mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸溶液和50mg/ml N-羥基琥珀酰亞胺，室溫震蕩反應；將活化好的磁珠置于磁力架上，棄上清，收集活化好的磁珠；加入豬瘟E2蛋白，室溫持續旋轉孵育30~240分鐘，反應時間取決于磁珠的配位基與濃度；上述磁珠置于磁力架上，棄上清，收集免疫磁珠；加入含有5%BSA0.05M pH 8.0的Tris-HCl緩沖液，重懸磁珠，封閉未偶聯豬瘟E2蛋白的活化羧基位點，反應30~60min；上述磁珠置于磁力架上，棄上清，加入免疫磁珠保存液。

6.如權利要求5所述的磁微粒熒光免疫試劑盒，其特征在于，所述的保存液為含5%BSA，5%蔗糖，0.1%Tween-20，0.1%PEG20000，0.05M pH 8.0的Tris-HCl緩沖液。

7.如權利要求3所述的磁微粒熒光免疫試劑盒，其特征在于，銪標抗體的制備方法為：將DTTA-Eu作為標記物，在0.05M pH8.0的碳酸鹽緩沖液下，加入DTTA-Eu與羊抗豬二抗，混合后溶于0.05M pH8.0的碳酸鹽緩沖液，室溫震蕩過夜；用葡聚糖凝膠柱過濾后收集峰管；將上述制備好的銪標二抗稀釋，使羊抗豬抗體的終濃度為0.0060~0.0075g/L。

8.如權利要求1所述的磁微粒熒光免疫試劑盒，其特征在于，所述洗滌液的配方為，0.05%Tween-20的磷酸鹽緩沖液。

9.如權利要求1所述的磁微粒熒光免疫試劑盒，其特征在于，所述增強液的配方為0.1~0.2M醋酸，0.1~0.2M鄰苯二甲酸氫鉀，5~15μM β-NTA，30~50μM TOPO，0.5~2ml Triton X-100。