[發(fā)明專利]一種稻瘟病菌小種分離鑒定方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201711296892.4
• 申請日: 2017-12-08
• 公開（公告）號(hào): CN108048591B
• 公開（公告）日: 2021-07-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 方治偉;李論;周俊飛;彭海;高利芬;胡長峰;劉致浩
• 申請（專利權(quán)）人: 江漢大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/6895
• 分類號(hào): C12Q1/6895;C12Q1/6869;C12Q1/04;C12R1/645
• 代理公司: 北京華沛德權(quán)律師事務(wù)所 11302
• 代理人: 房德權(quán)

1.一種稻瘟病菌小種分離鑒定方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)提取需要分離和鑒定的水稻葉片的總核酸，然后構(gòu)建高通量測序文庫；

(2)采用高通量測序的方法對文庫進(jìn)行高覆蓋深度的測序，并將測序結(jié)果比對到相應(yīng)物種的參考基因組上；

(3)根據(jù)比對結(jié)果獲取所有的變異位點(diǎn)，然后按照窗口平移獲得每個(gè)窗口的基因型數(shù)目，計(jì)算每個(gè)窗口的多態(tài)性，選擇多態(tài)性高且處于單拷貝區(qū)域作為候選分子標(biāo)記位點(diǎn)；所述變異位點(diǎn)的分析以測序片段為單位展開，標(biāo)記出每條測序片段上與參考基因組不同的每個(gè)堿基位點(diǎn)及其突變類型；把具有相同突變堿基位點(diǎn)和突變類型的reads定義為該窗口內(nèi)的一個(gè)基因型；

(4)在每個(gè)分子標(biāo)記位點(diǎn)的兩側(cè)尋找保守區(qū)域，在保守區(qū)域設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物；

(5)將需要分離和鑒定的水稻葉片做10倍稀釋后涂平板，恒溫培養(yǎng)后挑取單個(gè)的菌落并在新的固體培養(yǎng)基平板上純化后獲得單克隆的菌落；

(6)提取菌落的核酸后用步驟(4)設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行擴(kuò)增，對擴(kuò)增產(chǎn)物測序后分型；

(7)所有分型結(jié)果相同的單克隆僅保留一個(gè)；若有部分已發(fā)現(xiàn)基因型在所有克隆中都不存在，則重新挑取菌落純化并重復(fù)上述過程，直到獲得該稻瘟病菌小種。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的稻瘟病菌小種分離鑒定方法，其特征在于，所述步驟(1)中提取需要分離和鑒定的水稻葉片的總核酸時(shí)需要充分裂解細(xì)胞，確保提出每個(gè)小種的基因組序列。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的稻瘟病菌小種分離鑒定方法，其特征在于，所述步驟(2)中測序時(shí)產(chǎn)生的測序片段數(shù)量要達(dá)到200倍數(shù)據(jù)，確保所有小種均被有效檢測到。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的稻瘟病菌小種分離鑒定方法，其特征在于，所述步驟(3)中分子標(biāo)記位點(diǎn)的篩選以窗口平移的方式進(jìn)行，窗口長度設(shè)為L；在窗口平移的過程中僅僅考慮可以完整覆蓋該窗口的測序片段，其他測序片段均不考慮。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的稻瘟病菌小種分離鑒定方法，其特征在于，所述獲得該窗口的所有候選基因型，統(tǒng)計(jì)每類基因型的測序片段數(shù)量，并除以完整覆蓋該窗口的測序片段的總數(shù)量，從而獲得該基因型的頻率。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的稻瘟病菌小種分離鑒定方法，其特征在于，所述步驟(3)中選取的分子標(biāo)記位點(diǎn)在該物種中具有特有的特征片段，且在混合測序的樣品中表現(xiàn)出很高的多態(tài)性，多態(tài)性的計(jì)算方法為：

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的稻瘟病菌小種分離鑒定方法，其特征在于，所述步驟(3)中選取的分子標(biāo)記在基因組上處于單拷貝區(qū)域，基因組上其他位置不存在對該區(qū)域形成干擾的基因組片段；

單拷貝區(qū)域的判斷標(biāo)準(zhǔn)為：1.基于相似性判斷：如果有參考基因組，則首先保證參考基因組上其他位置沒有相似性大于90％、匹配長度大于100bp的區(qū)段；2.基于測序深度的判斷：其測序深度不超過臨近區(qū)域平均測序深度±3倍標(biāo)準(zhǔn)差，臨近區(qū)域指的是上下游各1，000bp的基因組區(qū)域。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的稻瘟病菌小種分離鑒定方法，其特征在于，所述步驟(4)中分子標(biāo)記兩側(cè)應(yīng)有適合于引物設(shè)計(jì)的保守區(qū)域；對于長度為L的一個(gè)滑動(dòng)窗口，窗口在基因組上的起始位置設(shè)為S，該窗口終止位置為E，則窗口左側(cè)保守區(qū)定義為坐標(biāo)位置小于S、在測序數(shù)據(jù)中以及已有的數(shù)據(jù)中均未發(fā)現(xiàn)變異的連續(xù)n個(gè)堿基位點(diǎn)，窗口左側(cè)保守區(qū)定義為坐標(biāo)位置大于E、在測序數(shù)據(jù)中以及已有的知識(shí)中均未發(fā)現(xiàn)變異的連續(xù)n個(gè)堿基位點(diǎn)，其中，n≥50；

所述保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)的引物3末端不含有低復(fù)雜序列。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的稻瘟病菌小種分離鑒定方法，其特征在于，所述步驟(5)中稀釋涂平板后過夜培養(yǎng)，然后挑取單個(gè)孢子在新的平板上繼續(xù)27℃恒溫培養(yǎng)；培養(yǎng)后通過菌落PCR獲得每個(gè)位點(diǎn)的擴(kuò)增產(chǎn)物；對擴(kuò)增產(chǎn)物測序后即可獲得每個(gè)擴(kuò)增位點(diǎn)的基因型信息；理論上每個(gè)克隆的每個(gè)擴(kuò)增位點(diǎn)只有一個(gè)基因型，若出現(xiàn)兩個(gè)及以上的基因型，且次高豐度的基因與最高豐度的基因型的豐度比值超過0.1；則認(rèn)為該菌落為非單克隆菌落，需重新純合；若豐度比值低于0.1，則認(rèn)為其他次高豐度的基因型為測序錯(cuò)誤引入，最高豐度基因型為該擴(kuò)增位點(diǎn)的真實(shí)基因型；

做稀釋涂平板時(shí)，稀釋的倍數(shù)應(yīng)以最低基因型的頻率為參考值：低于該值則會(huì)造成部分小種在在固體培養(yǎng)基丟失，高于該值則無法確保每個(gè)小種形成單菌落。