[發(fā)明專利]一種稻瘟病菌小種分離鑒定方法

有效

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• 申請日: 2017-12-08
• 公開（公告）號: CN108048591B
• 公開（公告）日: 2021-07-02
• 發(fā)明（設計）人: 方治偉;李論;周俊飛;彭海;高利芬;胡長峰;劉致浩
• 申請（專利權）人: 江漢大學
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6869;C12Q1/04;C12R1/645
• 代理公司: 北京華沛德權律師事務所 11302
• 代理人: 房德權

本發(fā)明公開了一種稻瘟病菌小種分離鑒定方法，屬于小種鑒定技術領域。提取樣品中的微生物的總核酸并構建高通量測序文庫；尋找基因組上的變異位點；通過滑動平移篩選高多態(tài)性位點，并在在候選位點兩側(cè)設計多重擴增引物；利用固體培養(yǎng)基分離樣品中的單菌落并做進一步純化，以獲得單克隆菌落；提取菌落的基因組DNA后利用上述步驟設計的引物進行擴增并測序；基于測序結(jié)果單克隆菌落進行分型，具有不同基因型的菌落作為不同的小種進行后續(xù)研究。本方法不需要預先知道樣品中的小種數(shù)量以及豐度等信息，也無需傳統(tǒng)的篩選過程中所需要生理生化鑒定試驗，只需通過高通量測序和擴增即可分離培養(yǎng)出樣品中的全部小種，過程簡單、快速且流程規(guī)范。

技術領域

本發(fā)明屬于小種鑒定技術領域，具體涉及一種稻瘟病菌小種分離鑒定方法。

背景技術

稻瘟病菌每年對水稻生產(chǎn)造成巨大的損失，嚴重情況下可能導致絕收。不同的稻瘟病小種對水稻品種的危害程度有很大的差異。在農(nóng)業(yè)防治中針對不同的稻瘟病小種應對策略也不同，因此確定分離、鑒定感染的是哪個小種是農(nóng)業(yè)防治的第一步。

小種又稱生理小種、株系等，是指形態(tài)上沒有明顯差異，但在生理生化特性、培養(yǎng)性狀、致病性等方面存在差異的同種微生物的不同群體。由于這些小種在致病性等特性上具有明顯的差異，因此在做菌種分離和鑒定時往往需要做到小種的水平才具有意義。

在現(xiàn)有技術中，至少存在以下問題：由于各小種之間在形態(tài)上沒有明顯差異，在獲取樣品并做分離培養(yǎng)后依然無法知道樣品中包含有幾個小種，具體是什么小種，只能通過酶切圖譜、生理生化等其他實驗對每個菌落逐個鑒別。這樣就會導致三個問題：一是對所需要的稀釋梯度沒有任何信息，只能盲目的稀釋后選擇若干梯度進行后續(xù)實驗；二是由于不知道具體有幾個小種，因此某些小種會被漏篩；三是需反復對多個單克隆菌落做生理生化分析來篩選小種，存在對同一個小種重復檢查的情況。其過程耗費大量人力物力，且不夠準確全面。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)的明目的是提供一種稻瘟病菌小種分離鑒定方法。

本發(fā)明所采用的技術方案是：

一種稻瘟病菌小種分離鑒定方法，包括以下步驟：

(1)提取需要分離和鑒定的水稻葉片的總核酸，然后構建高通量測序文庫；

(2)采用高通量測序的方法對文庫進行高覆蓋深度的測序，并將測序結(jié)果比對到相應物種的參考基因組上；

(3)根據(jù)比對結(jié)果獲取所有的變異位點，然后按照窗口平移獲得每個窗口的基因型數(shù)目，計算每個窗口的多態(tài)性，選擇多態(tài)性高且處于單拷貝區(qū)域作為候選分子標記位點；

(4)在每個分子標記位點的兩側(cè)尋找保守區(qū)域，在保守區(qū)域設計擴增引物；

(5)將需要分離和鑒定的水稻葉片做10倍稀釋后涂平板，恒溫培養(yǎng)后挑取單個的菌落并在新的固體培養(yǎng)基平板上純合后獲得單克隆的菌落；

(6)提取菌落的核酸后用步驟(4)設計的引物進行擴增，對擴增產(chǎn)物測序后分型；

(7)所有分型結(jié)果相同的單克隆僅保留一個；若有部分已發(fā)現(xiàn)基因型在所有克隆中都不存在，則重新挑取菌落純化并重復上述過程，直到獲得該稻瘟病菌小種。

進一步地，所述步驟(1)中提取需要分離和鑒定的水稻葉片的總核酸時需要充分裂解細胞，確保提出每個小種的基因組序列。

進一步地，所述步驟(2)中測序時產(chǎn)生的測序片段數(shù)量要達到200倍數(shù)據(jù)，確保所有小種均可以被有效檢測到。

進一步地，所述步驟(3)中分子標記位點的篩選以窗口平移的方式進行，窗口長度設為L；在窗口平移的過程中僅僅考慮可以完整覆蓋該窗口的測序片段，其他測序片段均不考慮。