[發明專利]一種基于熱擊的哈維弧菌同源重組基因敲除的方法

有效

• 申請號: 201711295414.1
• 申請日: 2017-12-08
• 公開（公告）號: CN107904228B
• 公開（公告）日: 2022-09-06
• 發明（設計）人: 鄧益琴;馮娟;貝蕾;蘇友祿
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院南海水產研究所
• 主分類號: C12N15/03
• 分類號: C12N15/03;C12N1/21;C12R1/63
• 代理公司: 廣州科粵專利商標代理有限公司 44001
• 代理人: 劉明星;朱聰聰

本發明公開了一種基于熱擊的哈維弧菌同源重組基因敲除的方法，包括以下步驟：將培養至對數早期的哈維弧菌受體菌熱擊處理后與培養至對數早期的供體菌進行等體積混勻，室溫離心去上清，菌沉淀后重懸，點種至固體平板上，接合過夜，通過對接合受體菌哈維弧菌熱擊處理，使得哈維弧菌的接合轉化效率從無到有，從而對哈維弧菌進行基因敲除。該方法在傳統的接合轉移法的技術基礎上，通過對接合受體菌哈維弧菌熱擊處理，使得哈維弧菌的接合轉化效率從無到有，成功對哈維弧菌進行基因敲除。

技術領域

本發明屬于哈維弧菌技術領域，具體涉及一種基于熱擊的哈維弧菌同源重組基因敲除的方法。

背景技術

哈維弧菌是一種革蘭氏陰性、發光呈彎曲短桿菌，具發酵能力，極生單鞭毛。哈維弧菌在海洋中的自由水體、浮游動植物體表、海底沉積物中大量存在，是一種普遍存在于海洋環境中的病原菌，可感染多種魚、蝦、蟹等并造成大量的死亡，給海水養殖業帶來巨大的損失。因此，闡明其致病機制并制備相關疫苗，進行免疫防控迫在眉睫。

基因敲除，又稱基因打靶，是一種新型的分子生物學技術，該技術利用接合轉化，將構建的打靶載體導入靶細胞后，通過重組載體DNA序列和靶細胞內染色體上的同源DNA序列，將載體DNA定點整合入靶細胞基因組上某一確定的位點，或與靶細胞基因組上某一確定片段置換，使機體特定的基因失活或缺失，從而改變細胞遺傳特性的方法。

致病機制研究通常涉及基因敲除的基因工程操作，而這些方法通常通過基因接合轉移法進行。但是，該方法的接合轉移效率對于不同種屬細菌存在差異。迄今為止，哈維弧菌的接合轉移效率一直很低甚至大多數菌株不能成功接合轉移，其基因敲除的常規同源重組法常常受到阻礙。

發明內容

本發明針對因哈維弧菌的接合轉化不成功或者效率低從而難以進行基因敲除的難題，通過對接合受體菌哈維弧菌進行熱擊處理，建立一種基于熱擊的哈維弧菌同源重組基因敲除的方法。

本發明的上述目的是通過如下技術方案實現的：一種基于熱擊的哈維弧菌同源重組基因敲除的方法，包括以下步驟：將培養至對數早期的哈維弧菌受體菌熱擊處理后與培養至對數早期的供體菌進行等體積混勻，室溫離心去上清，菌沉淀后重懸，點種至固體平板上，接合過夜，通過對接合受體菌哈維弧菌熱擊處理，使得哈維弧菌的接合轉化效率從無到有，從而對哈維弧菌進行基因敲除。

優選的，本發明熱擊處理時的溫度為35～50℃。

進一步的，本發明熱擊處理時的溫度為35～50℃時，熱擊處理時的時間為10min以上。

優選的，本發明在28℃接合過夜。

本發明所述的供體菌優選為攜帶有待缺失片段上下游同源臂的重組自殺質粒。

具體的，本發明中的基于熱擊的哈維弧菌同源重組基因敲除的方法，包括以下步驟：

(1)確定待突變基因X的上下游序列以及自殺質粒插入位點，利用NEB在線軟件(http://nebμilder.neb.com/)設計無縫克隆法重組子載體構建引物，得到上游同源臂擴增引物對X-UP-F/R、下游同源臂擴增引物對X-DOWN-F/R，自殺質粒線性化引物對P-F/R，重組子質粒檢測引物對P-check-F/R及待突變基因缺失檢測引物對X-Del-check-F/R；

(2)提取哈維弧菌基因組為模板，基于引物對X-UP-F/R和X-DOWN-F/R，利用PCR技術獲取擬敲除基因長度約為1000bp的上游同源臂片段UP及下游同源臂片段DOWN，瓊脂糖電泳檢測后切膠回收；

(3)提取自殺質粒為模板，基于引物對P-F/R，利用PCR技術獲取長度為3309bp的質粒片段P，瓊脂糖電泳檢測后切膠回收；