[發明專利]一種基于熱擊的哈維弧菌同源重組基因敲除的方法

有效

• 申請號: 201711295414.1
• 申請日: 2017-12-08
• 公開（公告）號: CN107904228B
• 公開（公告）日: 2022-09-06
• 發明（設計）人: 鄧益琴;馮娟;貝蕾;蘇友祿
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院南海水產研究所
• 主分類號: C12N15/03
• 分類號: C12N15/03;C12N1/21;C12R1/63
• 代理公司: 廣州科粵專利商標代理有限公司 44001
• 代理人: 劉明星;朱聰聰

1.一種基于熱擊的哈維弧菌同源重組基因敲除的方法，其特征是包括以下步驟：將培養至對數早期的哈維弧菌受體菌熱擊處理后與培養至對數早期的供體菌進行等體積混勻，室溫離心去上清，菌沉淀后重懸，點種至固體平板上，接合過夜，通過對接合受體菌哈維弧菌熱擊處理，使得哈維弧菌的接合轉化效率從無到有，從而對哈維弧菌進行基因敲除；

熱擊處理時的溫度為38℃；

熱擊處理時的時間為30min；

28℃接合過夜；

所述供體菌為pSW7848-△rbsB-E .coli GEB883，其構建方法如下；

(1)確定待突變基因rbsB的上下游序列以及自殺質粒pSW7848的插入位點，利用NEB在線軟件設計無縫克隆法重組子載體構建引物，得到上游同源臂擴增引物對rbsB-UP-F/R、下游同源臂擴增引物對rbsB-DOWN-F/R，自殺質粒線性化引物對pSW7848-F/R，重組子質粒檢測引物對pSW7848-check-F/R及待突變基因缺失檢測引物對rbsB-Del-check-F/R；

PCR引物序列如下：

rbsB-UP-F：aagcttgatatcgaattcgtcactgattgcactgttatttttg

rbsB-UP-R：tttacctgacgttctagtcctttgtgtaggg

rbsB-DOWN-F：ctagaacgtctggtaaagatgtactcatcgttggc

rbsB-DOWN-R：ttggtaacgaatcagacgccgcttcttgtgcgctg

pSW7848-F：gtctgattcgttaccaattatgacaac

pSW7848-R：gaattcgatatcaagcttatcgatac

pSW7848-check-F：tcactgtcccttattcgcacc

pSW7848-check-R：ctgcttttgagcactacccg

rbsB-Del-check-F：tgggtggtaaaggtcgcataa

rbsB-Del-check-R：tcgcctggacgagggaaag

(2)提取哈維弧菌基因組為模板，基于引物對rbsB-UP-F/R和rbsB-DOWN-F/R，利用PCR技術獲取996bp的上游同源臂片段UP及1022bp下游同源臂片段DOWN，具體如SEQ ID NO .1所示，瓊脂糖電泳檢測后切膠回收，回收產物-20℃保存，備用；

PCR擴增體系如下：

2×PrimeSTAR Max Premix 25 .0μL，上游引物F 10μM 2 .0μL，下游引物R 10μM 2 .0μL，基因組模板 20ng/μL 2 .0μL，用ddH2O補足50μL；

PCR擴增程序如下：

98℃預變性30sec；98℃變性10sec，55℃5sec，72℃5sec，35個循環；72℃延伸7min；

(3)提取自殺質粒為模板，基于引物對pSW7848-F/R，利用PCR技術獲取長度為3309bp的質粒線性化片段，瓊脂糖電泳檢測后切膠回收，回收產物-20℃保存，備用；

PCR擴增體系如下：

2×PrimeSTAR Max Premix 25 .0μL，上游引物F 10μM 2 .0μL，下游引物R 10μM 2 .0μL，質粒模板 1ng/μL 2 .0μL，用ddH2O補足50μL；

PCR擴增程序如下：

98℃預變性30sec；98℃變性10sec，53℃15sec，72℃17sec，35個循環；72℃延伸7min；

(4)利用商品化多片段無縫克隆試劑盒將步驟(2)獲得的上下游同源臂與步驟(3)獲得的質粒片段進行等溫組裝；

(5)將等溫組裝液轉化入大腸桿菌Escherichia coli GEB802感受態細胞，基于引物對pSW7848-check-F/R，利用PCR檢測后獲得陽性重組子pSW7848-△rbsB,如SEQ ID NO .2所示，瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，長度為2216bp；

PCR擴增體系如下：

2×Premix TaqTM 25 .0μL，上游引物F 10μM 2 .0μL，下游引物R 10μM 2 .0μL，菌液模板2 .0μL，用ddH2O補足50μL；

PCR擴增程序如下：

95℃預變性5min；94℃變性30sec，57℃30sec，72℃2 .5min，35個循環；72℃延伸10min；

(6)提取陽性重組質粒pSW7848-△rbsB轉化入大腸桿菌E .coli GEB883感受態細胞，得到攜帶了重組子的pSW7848-△rbsB-E .coli GEB883，并以其作為接合供體菌。