[發明專利]RAA熒光法檢測布魯氏桿菌的探針及試劑盒

在審

• 申請號: 201711294177.7
• 申請日: 2017-12-08
• 公開（公告）號: CN108048584A
• 公開（公告）日: 2018-05-18
• 發明（設計）人: 吳斌;蘇立明;張琳;馬嗣同;郭利川;王智宏;應清界
• 申請（專利權）人: 吳斌;江蘇奇天基因生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6844;C12Q1/04;C12N15/11;G01N21/64;C12R1/01
• 代理公司: 大連東方專利代理有限責任公司 21212
• 代理人: 劉慧娟;李馨

本發明公開一種檢測布魯氏桿菌RAA熒光法檢測試劑盒，檢測試劑盒包括以下組分：RAA基礎熒光通用反應試劑、反應緩沖液、探針與引物混合物、陰性質控品、陽性質控品及臨界陽性質控品。所述探針為5’端序列/熒光報告基團//idSp//淬滅基團/3’端序列；本試劑盒可直接對布魯氏桿菌DNA檢測，尤其可用于檢測布魯氏桿菌DNA含量較低的樣品；本試劑盒在30－42℃下進行等溫擴增檢測，5－20min完成檢測。試劑盒操作簡單，配合小型儀器、攜帶方便，具有快速、靈敏、準確、重復性好的優點；適合基層和現場檢測，具的良好的應用前景。

技術領域

本發明屬于分子生物學檢測領域，具體涉及一種檢測布魯氏桿菌RAA熒光法檢測的探 針、引物和試劑盒。

背景技術

布魯氏桿菌病(brucellosis)簡稱布病，亦稱“地中海熱”、“馬耳他熱”、“波伏熱”等，是 由一種布魯氏桿菌(Brucella)感染牛、羊、豬等家畜，通過呼吸道、消化道、皮膚及生殖系 統等引起的人畜共患高度傳染病。

布魯氏桿菌是一種革蘭氏陰性菌，其特點是不運動，幾乎無莢膜(光滑型有微莢膜)，嗜 氧菌，氧化酶、觸酶陽性，可還原硝酸鹽，細胞內寄生，能在家畜體內存活。它一共包括六 種：牛型布魯氏桿菌(流產布魯氏桿菌)、羊型布魯氏桿菌(馬耳他布魯氏桿菌)、豬布魯氏 桿菌、狗布魯氏桿菌、林鼠布魯氏桿菌和綿羊布魯氏桿菌等。布病主要發病于中東，非洲， 拉丁美洲，中亞和地中海周邊幾個地區，全球布魯氏桿菌病患者已達50萬左右，其疫情日趨 嚴重，從牧區、半牧區傳播至農區甚至向城市蔓延的趨勢。本菌侵入人體后，隨淋巴液到達 淋巴結，被吞噬細胞吞噬，如布菌未被吞噬細胞殺滅，則細菌在胞內生長繁殖，形成局部原 發病灶。此階段有人稱為淋巴源性遷徙階段，相當于潛伏期，潛伏期為7-60天，平均兩周， 少數患者可達數月或1年以上。細菌在吞噬細胞內大量繁殖導致吞噬細胞破裂，隨之大量細 菌進入淋巴液和血循環形成菌血癥。在血液里細菌又被血流中的吞噬細胞吞噬，并隨血流帶 至全身，在肝、脾、淋巴結、骨髓等處的單核—吞噬細胞系統內繁殖，形成多發性病灶，造 成臨床上不僅有菌血癥、敗血癥，而且還有毒血癥的表現。經一定時期后，感染灶的細菌生 長繁殖再次入血，導致疾病復發。組織病理損傷廣泛。臨床表現也就多樣化。如此反復成為 慢性感染，慢性期多侵及脊柱和大關節，表現為長期發熱(包括低熱)、多汗、關節痛兼或肝、 脾、淋巴結和睪丸腫大等可疑癥狀及體征。上個世紀我國經歷兩次大流行后疫情開始有了下 降趨勢，但本世紀初，疫情又有回升勢頭。到2007年初，已有25個省市自治區發現人間和 畜間布魯氏桿菌病。據統計我國受布魯氏桿菌感染潛在風險的人數達3.5億，每年新發病例 數約3萬人。布病是我國近年來發病人數增長迅速的傳染病之一。目前《中華人民共和國傳 染病防治法》已經把布魯氏桿菌病歸類為乙類傳染病，與我們更為熟悉的“非典”、“豬流感”、 “炭疽”、“艾滋病”、“狂犬病”、“乙肝”等同屬一類傳染病。

美國疾病控制中心(center for disease control，CDC)因此也認為它可以制成生化武器， 并將其定義為“B類生物恐怖主義藥劑”。由此可見布病具有巨大潛在威脅人們的身體健康， 它是一個嚴重的公共衛生問題，并引發嚴重的經濟損失和較高的全球健康負擔，預防布病傳 播成為我國和全球共同使命。

目前，布魯氏桿菌的傳統檢測技術主要包括病原分離技術、培養特性鑒定技術、血清學 檢測技術、免疫學學檢測技術及分子生物學等技術。

布魯氏桿菌病病原學檢測是從感染的血液或組織中分離培養布魯氏桿菌，利用固體培養基 如血清葡萄糖瓊脂、胰蛋白胨大豆瓊脂培養基進行培養，檢測原理是通過布魯氏桿菌的菌體 形態、染色特征、菌落形態、生長特性、生化反應特點以及布魯氏桿菌多克隆抗體凝集試驗 等方法進行鑒別。此方法法是布魯氏桿菌病診斷的“金標準”，其成本較低，具有定性和定量 分析特點。但同時存在分離率比較低、容易污染、耗時較長等問題，且分離布魯氏桿菌對環 境和工作人員存在生物安全風險，因而限制了該方法的使用。

血清檢查是醫學上常用的一種檢測手段，包括各種凝集反應、補體結合反應、沉淀反應 等。