[發明專利]一種黑曲霉種子培養及其制備檸檬酸的方法

有效

• 申請號: 201711293931.5
• 申請日: 2017-12-08
• 公開（公告）號: CN107815421B
• 公開（公告）日: 2020-06-05
• 發明（設計）人: 石貴陽;劉龍;陳堅;胡志杰;蔣建偉;蔣小東;金賽;孫福新;李由然;周東姣
• 申請（專利權）人: 江蘇國信協聯能源有限公司;江南大學
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14;C12P7/48;C12R1/685
• 代理公司: 無錫華源專利商標事務所(普通合伙) 32228
• 代理人: 聶啟新

本發明公開了一種黑曲霉種子培養及其制備檸檬酸的方法，所述方法包括如下步驟：(1)取培養成熟的黑曲霉麩曲孢子，得到分散孢子懸液；(2)培養步驟(1)中的分散孢子懸液，得到發芽孢子；(3)發芽孢子重新分散，種子罐內培養，得到成熟種子液；(5)成熟種子液轉至發酵罐內培養發酵，得到檸檬酸發酵液。本發明解決了孢子萌發過程中聚集的問題，提高孢子成球率，增加菌絲球數量，有效控制菌絲球的大小均一性，提高菌體的轉化效率，發酵轉化率提高，發酵周期縮短。

技術領域

本發明涉及微生物發酵技術領域，尤其是涉及一種利用特殊培養的黑曲霉種子液制備檸檬酸的方法。

背景技術

檸檬酸是一種重要的有機酸，又名枸櫞酸，無色無臭，有很強的酸味，易溶于水，在工業，食品業，化妝業等具有極廣泛的用途。目前，檸檬酸主要通過發酵法生產獲得，以玉米等淀粉質農作物作為原料。

傳統檸檬酸發酵通常是先進行黑曲霉孢子擴培，得到成熟的孢子；然后孢子接入種子培養基中獲得成熟的種子液；最后將種子液移入發酵培養基中發酵得到檸檬酸發酵液。

傳統種子培養通常需要24-32h，培養周期較長。而在種子培養過程中，前期0-8h主要是黑曲霉孢子吸水膨脹，孢子萌發，恢復代謝活動的過程，8h后才進入菌絲生長的階段。前期孢子吸水膨脹到萌發，幾乎不消耗營養物質，只需要少量營養物質促進其恢復代謝活力；另外幾乎不消耗溶解氧，對攪拌、轉速、風量要求低；而菌絲生長階段則需要消耗大量的營養物質和溶氧，并且pH會逐漸下降至2.0以下。傳統種子培養過程中，孢子萌發和菌絲生長均在種子罐內，種子罐培養時間增加1/3，降低種子罐利用率，增加前期能耗。

另外，由于孢子間存在電荷吸附作用，分散的孢子容易重新聚集成團，結團后多個孢子只能形成一個菌絲球，導致孢子形成菌絲球的比例降低，傳統種子培養過程中孢子成球率只有60％；而且菌絲球大小不均一，部分菌絲球直徑偏大，中心形成致密區，無法與營養物質和氧氣有效接觸，導致菌體轉化效率降低。

因此，如何改進黑曲霉種子培養方法，縮短種子培養時間，提高種子罐利用率；以及提高孢子成球率，和控制菌絲球均一性是檸檬酸發酵生產中亟待解決的一個重要問題。

發明內容

針對傳統技術存在的上述問題，本發明申請人提供了一種黑曲霉種子培養及其制備檸檬酸的方法。本發明方法將黑曲霉孢子萌發與菌絲體生長兩階段分開培養，孢子萌發在小容器中進行，孢子萌發后轉接至種子罐內進行菌絲生長，縮短種子培養時間，提高種子罐利用率。本發明解決了孢子萌發過程中聚集的問題，提高孢子成球率，增加菌絲球數量，有效控制菌絲球的大小均一性，提高菌體的轉化效率，發酵轉化率提高，發酵周期縮短。

本發明的技術方案如下：

一種黑曲霉種子培養及其制備檸檬酸的方法，包括如下步驟：

(1)取培養成熟的黑曲霉麩曲孢子，加入5～10倍體積的無菌水，震蕩浸泡0.5～12h，用四層紗布過濾，得到分散孢子懸液；

(2)將步驟(1)中的分散孢子懸液接入稀糖液中，在溫度為30～42℃，pH為3.5～6.0，攪拌轉速為0～100rpm的條件下，培養4～10h，得到發芽孢子；所述稀糖液中含有麩皮或淀粉渣顆粒物質，使得固形物含量為10～100g/L，另外，稀糖液中添加體積百分比為0.05～0.1％的吐溫80；

(3)培養結束后，將攪拌轉速提高至200～1000rpm，攪拌0.5～2h，將聚集的發芽孢子重新分散；

(4)將步驟(3)中分散的發芽孢子，轉接至種子罐內，在溫度為35～39℃，風量為0.2～0.6vvm，罐壓為0.05～0.1Mpa，攪拌轉速為100～200rpm的條件下，培養10～16h，得到成熟種子液；

(5)將步驟(4)中成熟種子液轉至發酵罐內培養，還原糖低于5g/L停止發酵，得到檸檬酸發酵液。