[發明專利]一種測定鱗狀上皮細胞癌抗原含量的試劑盒及其測試方法

在審

• 申請號: 201711288526.4
• 申請日: 2017-12-07
• 公開（公告）號: CN108169486A
• 公開（公告）日: 2018-06-15
• 發明（設計）人: 汪丹;劉振世;薛黎;金鑫;徐茜茜
• 申請（專利權）人: 江蘇澤成生物技術有限公司
• 主分類號: G01N33/574
• 分類號: G01N33/574;G01N33/543;G01N21/76
• 代理公司: 北京聯瑞聯豐知識產權代理事務所(普通合伙) 11411
• 代理人: 黃冠華

1.一種測定鱗狀上皮細胞癌抗原含量的試劑盒，其特征在于，包括校準品、質控品、抗試劑、磁微粒試劑、發光底物；

所述磁微粒試劑是將抗異硫氰酸熒光素抗體與羧基磁珠偶聯制成，所述發光底物是將ALPS溶解于發光底物緩沖液中制成；

分別配制校準品、質控品、抗試劑、磁微粒試劑、發光底物；將校準品、質控品、抗試劑、磁微粒試劑、發光底物，獨立地置于包裝容器內，得到鱗狀上皮細胞癌抗原的定量測定試劑盒；

(一)、所述校準品、質控品的配制，包括以下步驟：

用校準品緩沖溶液溶解SCC，完全溶解后經過0.22μm濾膜處理制備而成；

(二)、所述抗試劑的配制：

1)抗試劑緩沖液的制備：

將10g～20g的Tris、5g～6g的NaCl、0.5～1.0g的NaN₃、1g～5g的綿羊血清、3g～10g的新生牛血清、1g～5g的馬血清加入1L純化水中，充分攪拌至完全溶解，用MgCl和ZnCl調節pH至8～9，制得所述抗試劑緩沖液；

2)異硫氰酸熒光素與SCC抗體偶聯，獲得異硫氰酸熒光素標記的SCC包被抗體：

首先用抗試劑緩沖液將異硫氰酸熒光素配制成濃度為1.0～5.0mg/mL的異硫氰酸熒光素溶液，然后按照SCC抗體：異硫氰酸熒光素溶液＝1:1.1～1:1.5的質量比將二者轉移到棕色玻璃瓶里，充分混勻；充分反應后使用pH為8～9的碳酸鹽緩沖液平衡，然后使用凝膠層析分離純化得到異硫氰酸熒光素標記的鱗狀上皮細胞癌抗原包被抗體；

3)堿性磷酸酶與SCC抗體偶聯，獲得堿性磷酸酶標記的SCC抗體：

首先用緩沖液將堿性磷酸酶配制成濃度為1.0～5.0mg/mL的堿性磷酸酶溶液，SCC抗體和堿性磷酸酶分別將反應基團分別活化后按照摩爾比為堿性磷酸酶：SCC抗體＝1:1～1:3的反應比在催化劑的催化下充分混勻進行偶聯反應，充分反應后，使用pH為8～9的tris緩沖液平衡，凝膠柱進行不同分子大小片度的分離純化，得到堿性磷酸酶標記的鱗狀上皮細胞癌抗原標記抗體；

將步驟2)中獲得的異硫氰酸熒光素標記的鱗狀上皮細胞癌抗原包被抗體和步驟3)中獲得的堿性磷酸酶標記的SCC抗體加入含有表面活性劑的磷酸鹽緩沖液中，充分攪拌后獲得所述抗試劑。

2.根據權利要求1所述的測定鱗狀上皮細胞癌抗原含量的試劑盒，其特征在于，所述步驟3)中的表面活性劑為Tween 20、Triton X-100、Bronidox中的一種或多種，表面活性劑的添加量為0.01％～0.5％。

3.根據權利要求1或2任一項所述的測定鱗狀上皮細胞癌抗原含量的試劑盒，其特征在于所述磁微粒試劑是按照以下步驟制備的：

1)將充分混勻后的羧基磁珠濃縮液放入反應瓶中，將該反應瓶在磁場內放置15～20min，待羧基磁珠全部沉降后吸去上清，向反應瓶中加入相當于反應瓶中羧基磁珠體積2～5倍的磁微粒緩沖液，震蕩清洗20～30min；再將反應瓶置于磁場中15～20min后吸去上清；重復清洗羧基磁珠3遍；最后將羧基磁珠溶液定容到10～50mg/mL，混勻待用；

2)連接反應：按照質量比羧基磁珠溶液：抗異硫氰酸熒光素抗體＝100:1的比例在步驟1)所制得的羧基磁珠溶液中加入抗異硫氰酸熒光素抗體，在2～8℃內保持混勻狀態反應18小時；

3)反應瓶在磁場中放置15min，待羧基磁珠沉降后用磁微粒緩沖液洗3遍，隨后定容至10mg/mL，2～8℃保存，制得所需待用磁微粒試劑。

4.根據權利要求3任一項所述的測定鱗狀上皮細胞癌抗原含量的試劑盒，其特征在于，所述磁微粒緩沖液的配置方法是將12.12～15.26mg的Tris，5.82～8.58mg的氯化鈉，50～60g的甲基纖維醚加入到1L純化水中，充分攪拌至完全溶解即得。

5.利用權利要求1或2任一項所述的試劑盒測定鱗狀上皮細胞癌抗原含量的方法，其特征在于該方法包括以下步驟：

1)取三支試管分別加15μL校準品、15μL質控品、15μL待測樣本；

2)每支試管中加入60μL抗試劑，用塑料薄膜覆蓋試管，輕輕振蕩試管30s，置于37℃下水浴30min；

3)每支試管中加入30μL磁微粒試劑，用塑料薄膜覆蓋試管，輕輕振蕩試管30s，置37℃下水浴5min；

4)將試管在磁分離器上沉淀3min，緩慢地倒轉試管和磁分離器，倒出上清液；把倒轉的試管連同磁分離器一起，放在濾紙上，拍擊磁分離器底部以除去粘在管壁上的所有液滴；

5)每支試管中加入30μL清洗液，用塑料薄膜覆蓋試管，輕輕振蕩試管30s，混勻后緩慢的倒轉試管和磁分離器，倒出上清液，把倒轉的試管連同磁分離器一起，放在濾紙上，用力拍擊分離器底部以除去粘在管壁上的所有液滴；

6)重復步驟5)一次；

7)每支試管中加入200μL發光底物，振蕩混勻3s，用化學發光儀檢測發光強度。