[發明專利]14種高危型人乳頭狀瘤病毒E6/E7區mRNA檢測試劑盒

在審

• 申請號: 201711283121.1
• 申請日: 2017-12-07
• 公開（公告）號: CN107841576A
• 公開（公告）日: 2018-03-27
• 發明（設計）人: 李烈軍;鄭振淵;徐愛娟;盧敏;謝龍旭
• 申請（專利權）人: 廣州凱普醫藥科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種14種高危型人乳頭狀瘤病毒E6/E7區mRNA檢測試劑盒，包括：

（1）用于檢測E6/E7區mRNA序列的一組TaqMan水解探針，序列為SEQ ID NO.1-7；

（2）用于特異性擴增E6/E7區mRNA序列的一組RT-PCR的引物，序列為SEQ ID NO.8-36。

2. 根據權利要求1所述試劑盒，其特征在于, 所述用于檢測14種高危型人乳頭狀瘤病毒E6/E7區mRNA的TaqMan水解探針為SEQ ID NO.1-6，其5’端標記熒光基團FAM,其3’端標記淬滅熒光基團BHQ1；

所述用于檢測細胞內對照β2微球蛋白mRNAmRNA的TaqMan水解探針為SEQ ID NO.7，其5’端標記熒光基團HEX/JOE，其3’端標記淬滅熒光基團BHQ1。

3.一種用PCR-熒光探針法檢測14種高危型人乳頭狀瘤病毒E6/E7區mRNA檢測的方法，包括以下步驟：

提取樣本RNA；

用DNase Ⅰ消化步驟（1）中提取的RNA中的DNA；

以步驟（2）中得到的RNA為模板，利用SEQ ID NO.8-36所述的引物進行特異性擴增E6/E7區mRNA及細胞內對照β2微球蛋白mRNA，得到PCR產物；

以SEQ ID NO.1-7所述的TaqMan水解探針，與步驟（3）所述PCR產物雜交，以達到設定閾值時所需的循環次數Ct值作為結果判斷的標準；

Ct≤37：陽性；

37<Ct<45：可疑；取樣本重新進行RNA提取和PCR檢測，如重測結果Ct≤37，則判定為陽性；如重測結果Ct>37或無Ct值，則判定為陰性；

Ct>45或為0, 其內對照B2M在HEX熒光檢測通道Ct值≤37：陰性；

樣本在各熒光檢測通道Ct值顯示為Undet，判斷為無效，重新采樣；

所述PCR擴增的反應體系為：25μl反應體系含1×Reaction Mix （10mM Tris-HCl，0.2mM dNTP，3mM MgSO₄）,5.5mM MgSO₄，5.6μM擴增引物，1.4μM的水解探針，2.5U Taq酶，5μlDNA模板；

所述PCR擴增的反應條件為：50℃逆轉錄15min， 95°C熱啟動2min，95℃變性15 sec、60°C退火60 sec，共45個循環，最后一步38°C保存30sec；

PCR擴增時使用7500 Real Time PCR System在第二個循環周期的60°C退火階段采集FAM和HEX通道的熒光數據。