[發明專利]14種高危型人乳頭狀瘤病毒E6/E7區mRNA檢測試劑盒

在審

• 申請號: 201711283121.1
• 申請日: 2017-12-07
• 公開（公告）號: CN107841576A
• 公開（公告）日: 2018-03-27
• 發明（設計）人: 李烈軍;鄭振淵;徐愛娟;盧敏;謝龍旭
• 申請（專利權）人: 廣州凱普醫藥科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及基因領域，具體是一種對14種高危型HPV E6/E7 mRNA檢測試劑盒。

背景技術

人乳頭狀瘤病毒（human papillomavirus，HPV）自20世紀70年代末到20世紀80年代初發現與宮頸癌相關以來，一直受人們的關注。大量的研究結果表明：HPV在宮頸細胞異常以及宮頸癌的病理學上具有最為重要的作用。對宮頸癌組織標本的研究發現，99%以上的宮頸癌存在HPV感染。高危型HPV的持續感染是宮頸癌及其癌前病變發生發展的必要條件。在感染的潛伏期或宮頸癌前病變階段檢測出高危型HPV并采取適當的治療措施，可以有效地阻斷宮頸癌的發生。早期篩查、診斷和治療癌前病變及宮頸癌是目前降低宮頸癌發病率和死亡率的關鍵。

目前，100多種HPV基因型已被鑒定，其中約40種與生殖道感染相關。高危型主要與宮頸上皮內瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）Ⅱ、Ⅲ級和宮頸癌的發生相關，其已明確有14種包括HPVl6、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和68型。低危型一般與惡性病變無關，主要引起尖銳濕疣和低級別CIN（CINⅠ）。高危型HPV檢測已經被推薦單獨或聯合細胞學應用于宮頸癌篩查。

美國及歐洲多所權威科研機構及大學研究證實E6/E7 mRNA水平與病變的嚴重程度相關。HPV E6/E7 mRNA在宮頸組織中表現癌基因活性。E6/E7致癌蛋白是細胞惡性轉化的主要原因，一旦HPV整合進入人的基因組，E6/E7 mRNA的表達將不受限制，將增加到一個引起惡性轉化的水平。歐洲權威專家評論文章報道高危型HPV E6/E7 mRNA的表達與病變嚴重程度的相關性檢測在靈敏度方面與HPV DNA檢測差不多，但在特異性方面卻優于HPV DNA檢測。因此，開發14種高危型HPV E6/E7 mRNA檢測試劑盒對于宮頸癌的早期診斷、控制發展及預后監測有著極其重大的意義。

由于HPV無法在體外細胞培養，且不能誘導易于檢測的免疫反應，所以不能采用血清學的方法進行HPV的檢測，HPV的準確確定依賴于分子生物學技術。形態學以及臨床觀察僅僅對于HPV的存在提供一些推斷性支持。

目前國內外對HPV進行檢測的方法主要集中在以靶序列擴增為基礎的檢測和以信號放大為基礎的檢測技術兩方面。

如注冊號為國食藥監械(進)字2014第3402263號產品“人乳頭狀瘤病毒檢測試劑盒(捕獲雜交法)”，因聯合檢測試劑盒”，該產品用于定性檢測源自宮頸樣本中14種型別的人乳頭狀瘤病毒(HPV)的E6/E7病毒信使RNA (mRNA)，但不區分具體型別。14種型別包括16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和68型。注冊號為國食藥監械(進)字2014第3402263號產品“人乳頭狀瘤病毒16/18/45基因型檢測試劑盒(捕獲雜交法)” 該產品用于定性檢測源自宮頸樣本中人乳頭狀瘤病毒(HPV)16，18和45亞型的E6/E7病毒信使RNA (mRNA)，但不區分18和45亞型。

目前，臨床上還沒有能夠基于多重熒光PCR技術，通過實時熒光PCR儀，進行一步法RT-PCR核酸擴增與檢測出HPV E6/E7 mRNA的產品。

發明內容

本發明的目的是為了解決上述問題，提供一種14種高危型人乳頭狀瘤病毒E6/E7區mRNA檢測試劑盒，該試劑盒可應用于多重熒光PCR技術，對一般樣本的14種高危型人乳頭狀瘤病毒初篩檢測，其操作簡便、結果客觀準確。

本發明的第二個目的在于提供一種14種高危型人乳頭狀瘤病毒E6/E7區mRNA檢測方法，該方法可在同一反應管中通過儀器兩種熒光檢測通道分別檢測14種高危型HPV 的E6/E7區mRNA及細胞內對照β2微球蛋白mRNA的的試劑盒。細胞內對照β2微球蛋白mRNA用于評估樣本質量及PCR抑制因素。

為了達到上述目的，本發明采用如下技術方案：

一種14種高危型人乳頭狀瘤病毒E6/E7區mRNA檢測試劑盒，包括：

（1）用于檢測E6/E7區mRNA序列的一組TaqMan水解探針，序列為SEQ ID NO.1-7；

（2）用于特異性擴增E6/E7區mRNA序列的一組RT-PCR的引物，序列為SEQ ID NO.8-36。