[發明專利]一種鱘魚顯微注射的方法及應用

有效

• 申請號: 201711282296.0
• 申請日: 2017-12-07
• 公開（公告）號: CN107760722B
• 公開（公告）日: 2020-11-06
• 發明（設計）人: 胡煒;胡紅霞;陳戟;朱華;王巍;朱作言
• 申請（專利權）人: 中國科學院水生生物研究所;北京市水產科學研究所
• 主分類號: C12N15/89
• 分類號: C12N15/89;C12N15/90
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所 42001
• 代理人: 龔瑩瑩

1.一種鱘魚顯微注射的方法，包括，在鱘魚卵受精后的二十分鐘內向鱘魚1細胞期受精卵動物極的受精孔中進行顯微注射；

所述的受精卵的制備過程包括：挑選性成熟的親魚，在室內養殖系統中注射LHRHa和DOM混合物進行人工催產繁殖；注射劑量為10μg LHRHa+1mg DOM/kg體重，每隔12個小時注射1次，雌性鱘魚共注射2次，雄性鱘魚注射1次；注射24小時后，分別擠出精液和卵到干燥的燒杯，用0.3×Danieau buffer將精液稀釋100倍，進行人工授精，得到鱘魚1細胞期的受精卵；

所述的Danieau buffer：17mM NaCl，2mM KCl，0.12mM MgSO₄，1.8mM Ca(NO₃)₂，1.5mMHEPES，pH 7.6。

2.根據權利要求1所述的方法，所述的鱘魚包括小體鱘，西伯利亞鱘(A.baerii)、施氏鱘(A.schrenckii)或俄羅斯鱘(A.gueldenstaedtii)。

3.權利要求1所述的方法在鱘魚基因轉移中的應用。

4.根據權利要求3所述的應用，其應用步驟包括，將包含有待轉移目的基因片段的質粒，利用顯微操作的方式注射到受精時間不超過20分鐘的鱘魚1細胞期受精卵動物極的受精孔中。

5.權利要求1所述的方法在鱘魚外源基因編輯中的應用。

6.根據權利要求5所述的應用，其應用步驟包括：將靶基因質粒和針對靶位點的TALENmRNA，利用顯微操作的方式注射到受精時間不超過20分鐘的鱘魚1細胞期受精卵動物極受精孔中。

7.權利要求1所述的方法在鱘魚內源基因編輯中的應用。

8.根據權利要求7所述的應用，其應用步驟包括：將Cas9蛋白與靶基因gRNA混合后，利用顯微注射的方式，注射到受精時間不超過20分鐘的鱘魚1細胞期受精卵的動物極受精孔中。