[發明專利]一種鱘魚顯微注射的方法及應用

有效

• 申請號: 201711282296.0
• 申請日: 2017-12-07
• 公開（公告）號: CN107760722B
• 公開（公告）日: 2020-11-06
• 發明（設計）人: 胡煒;胡紅霞;陳戟;朱華;王巍;朱作言
• 申請（專利權）人: 中國科學院水生生物研究所;北京市水產科學研究所
• 主分類號: C12N15/89
• 分類號: C12N15/89;C12N15/90
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所 42001
• 代理人: 龔瑩瑩

本發明公開了一種鱘魚顯微注射的方法及應用，在鱘魚卵受精后的二十分鐘內向鱘魚1細胞期受精卵動物極的受精孔中進行顯微注射，當質粒注射濃度為50?100 ng/μL時，能同時保證基因轉移的高成功率50?70%，以及受體鱘魚胚胎經顯微操作處理后的高存活率83?90%，利用該方法進行鱘魚內源或外源基因編輯，也可獲得高存活率和高突變率的胚胎，為開展鱘魚基因的功能研究和鱘魚養殖品種的遺傳改良提供了強有力的技術手段。

技術領域

本發明涉及水產動物遺傳育種和功能基因驗證研究的技術領域，更具體涉及一種鱘魚顯微注射的方法及應用。

背景技術

鱘魚在生物系統演化方面處于軟骨魚和硬骨魚之間的過渡時期，具有多倍化的基因組，在研究魚類基因功能及演化方面具有重要的研究價值。但是，在鱘魚中開展基因功能研究，現有的報道僅局限于基因克隆和表達模式分析(Abdolahnejad等，2015.Dong等，2015.Fajkowska等，2016.Song等，2016.Yarmohammadi等，2017)。鱘形目魚類屬大型經濟魚類。鱘魚不僅肉質鮮美，營養全面，富含多種人體必需氨基酸和不飽和脂肪酸，而且是重要的魚子醬生產材料(Simeanu等，2012)。但是，由于人類過度捕撈及水生態環境的破壞，野生鱘魚資源急劇下降，很多鱘魚甚至處于瀕危狀態(Billard等，2000)。開展鱘魚的遺傳育種，培育鱘魚養殖品種，是滿足人類對鱘魚產品日益增長的需求，保護野生鱘魚資源的關鍵。但是，鱘魚的基因功能研究和遺傳改良育種一直受制于缺乏有效的技術手段。

顯微注射法是進行魚類基因轉移或者編輯的經典方法，適合采用顯微注射法的魚卵具有卵殼柔軟、透明，而且動物極清晰的特點。但是，鱘魚受精卵的特點為黑色不透明，卵殼堅硬且受精后產生很強的粘性，難以酶解去除，存在不適宜進行胚胎顯微操作的問題。

針對上述問題，本發明提供了一種鱘魚顯微注射的方法，可以利用該方法對鱘魚進行基因轉移，外源基因或者內源基因的精準編輯，為開展鱘魚基因的功能研究和鱘魚養殖品種的遺傳改良提供了強有力的技術手段。

發明內容

本發明的目的在于提供了一種鱘魚顯微注射的方法，方法簡單，利用本發明的方法，可以成功實施基因的顯微注射操作，獲得的轉基因鱘魚的成功率高，存活率高。

本發明還提供了一種鱘魚顯微注射的方法的應用，包括利用該方法進行基因轉移，進行鱘魚的外源基因編輯或內源基因編輯。

為了達到上述目的，本發明采取以下技術措施：

一種鱘魚顯微注射的方法，包括，在鱘魚卵受精后的二十分鐘內向鱘魚1細胞期受精卵動物極的受精孔中進行顯微注射。

以上所述的方法中，優選的，所述的鱘魚包括但不限于小體鱘，西伯利亞鱘(A.baerii)、施氏鱘(A.schrenckii)、俄羅斯鱘(A.gueldenstaedtii)等。

一種鱘魚顯微注射的方法的應用，包括但不限于利用本發明提供的顯微注射方法進行基因轉移，鱘魚的外源基因編輯或內源基因編輯。

以上所述的應用中，優選的，鱘魚顯微注射的方法在基因轉移中的應用步驟包括，將包含有待轉移目的基因片段的質粒，利用顯微操作的方式注射到受精時間不超過20分鐘的鱘魚1細胞期受精卵動物極的受精孔中；

以上所述的應用中，優選的，鱘魚顯微注射的方法在鱘魚的外源基因編輯中的應用步驟包括：在鱘魚卵受精后的二十分鐘內，將靶基因質粒和針對靶位點的TALEN mRNA，利用顯微操作的方式注射到受精時間不超過20分鐘的鱘魚1細胞期受精卵動物極受精孔中；

以上所述的應用中，優選的，鱘魚顯微注射的方法在鱘魚的內源基因編輯中的應用步驟包括：將Cas9蛋白與靶基因gRNA混合后，利用顯微注射的方式，注射到受精時間不超過20分鐘的鱘魚1細胞期受精卵的動物極受精孔中；

以上所述的應用中，優選的，每枚受精卵注射體積為2nL。