[發明專利]一種鱘魚CRISPR/Cas9基因編輯方法

有效

• 申請號: 201711282089.5
• 申請日: 2017-12-07
• 公開（公告）號: CN107974466B
• 公開（公告）日: 2020-09-29
• 發明（設計）人: 陳戟;胡紅霞;胡煒;朱華;王巍;朱作言
• 申請（專利權）人: 中國科學院水生生物研究所;北京市水產科學研究所
• 主分類號: C12N15/89
• 分類號: C12N15/89;C12N15/10;A01K67/027
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所 42001
• 代理人: 龔瑩瑩

本發明提供了一種鱘魚CRISPR/Cas9基因編輯方法，是將Cas9蛋白與靶基因gRNA混合后，利用顯微注射的方式，注射到受精時間不超過20分鐘的鱘魚1細胞期受精卵的動物極的受精孔中。將100 ng/μL Cas9 nuclease蛋白與30 ng/μL gRNA混合，采用顯微注射方法，將混合物導入小體鱘1細胞期受精胚的動物極，孵化后可獲得靶基因突變率高達83.1%的小體鱘胚胎，從而建立小體鱘靶基因精準編輯技術。靶基因發生突變的小體鱘胚胎可通過PAGE方法篩選獲得。該技術既可以用于研究鱘魚基因的功能，又可以用于精準修飾鱘魚內源靶基因，培育遺傳改良的鱘魚養殖新品系。

技術領域

本發明涉及水產動物遺傳育種和功能基因驗證研究的技術領域，更具體涉及一種鱘魚CRISPR/Cas9基因編輯方法。

背景技術

鱘魚在生物系統演化方面處于軟骨魚和硬骨魚之間的過渡時期，具有多倍化的基因組，在研究魚類基因功能及演化方面具有重要的研究價值。但是，在鱘魚中開展基因功能研究，現有的報道僅局限于基因克隆和表達模式分析(Abdolahnejad等，2015.Dong等，2015.Fajkowska等，2016.Song等，2016.Yarmohammadi等，2017)。鱘形目魚類屬大型經濟魚類。鱘魚不僅肉質鮮美，營養全面，富含多種人體必需氨基酸和不飽和脂肪酸，而且是重要的魚子醬生產材料(Simeanu等，2012)。但是，由于人類過度捕撈及水生態環境的破壞，野生鱘魚資源急劇下降，很多鱘魚甚至處于瀕危狀態(Billard等，2000)。

開展鱘魚的遺傳育種，培育鱘魚養殖品種，是滿足人類對鱘魚產品日益增長的需求，保護野生鱘魚資源的關鍵。但是，鱘魚的基因功能研究和遺傳改良育種一直受制于缺乏有效的技術手段。

基因編輯技術是利用靶向性的序列特異核酸酶對基因組進行定點突變或精準修飾的技術，包括鋅指核酸酶ZFN、TALE核酸酶和CRISPR/Cas9系統。基因編輯技術在基因功能研究與經濟物種的遺傳改良中得到了廣泛應用。迄今已在斑馬魚、青鱂等模式魚類和羅非魚、虹鱒、鯉魚、溝鯰、野鯪、半滑舌鰨和黃鱔等經濟魚類中建立了高效的基因編輯技術(Doyon et al,2008；Ansai et al,2013；Qiu et al,2014；Li et al,2014；Yano et al,2014；Zhong et al,2016；Qin et al,2016；Chakrapani et al,2016；Cui et al,2017；Feng et al,2017)。但是，迄今沒有在鱘魚中建立基因編輯技術。

因此，建立鱘魚基因編輯技術，一方面可以用于鱘魚功能基因研究；另一方面可以用于探索研制鱘魚養殖新品系，為養殖鱘魚提供遺傳改良的優良品種，保護鱘魚野生資源。

發明內容

本發明提供了一種鱘魚CRISPR/Cas9基因編輯的方法，通過構建靶基因的規律成簇間隔短回文重復(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/associated nuclease9,CRISPRs/Cas9)基因編輯載體，體外轉錄合成靶基因的gRNA，將Cas9nuclease蛋白與靶基因gRNA混合，采用顯微注射方法，將混合物導入受精時間不超過20分鐘的鱘魚1細胞期受精卵的動物極受精孔中，孵化后可獲得靶基因突變的鱘魚。

為了達到上述的目的，本發明采用以下技術措施：

一種鱘魚CRISPR/Cas9基因編輯的方法，包括：將Cas9蛋白與靶基因gRNA混合后，利用顯微注射的方式，注射到受精時間不超過20分鐘的鱘魚1細胞期受精卵的動物極的受精孔中；

以上所述的方法中，優選的，所述的鱘魚包括但不限于小體鱘，西伯利亞鱘(A.baerii)、施氏鱘(A.schrenckii)、俄羅斯鱘(A.gueldenstaedtii)；