[發(fā)明專利]一種鱘魚CRISPR/Cas9基因編輯方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201711282089.5
• 申請(qǐng)日: 2017-12-07
• 公開（公告）號(hào): CN107974466B
• 公開（公告）日: 2020-09-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳戟;胡紅霞;胡煒;朱華;王巍;朱作言
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所;北京市水產(chǎn)科學(xué)研究所
• 主分類號(hào): C12N15/89
• 分類號(hào): C12N15/89;C12N15/10;A01K67/027
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務(wù)所 42001
• 代理人: 龔瑩瑩

1.一種鱘魚CRISPR/Cas9基因編輯的方法，包括：將Cas9蛋白與靶基因gRNA混合后，利用顯微注射的方式，注射到受精時(shí)間不超過20分鐘的鱘魚1細(xì)胞期受精卵的動(dòng)物極的受精孔中；

所述的受精卵的制備方法包括：挑選性成熟的鱘魚親魚，在室內(nèi)養(yǎng)殖系統(tǒng)中暫養(yǎng)；距人工繁殖36小時(shí)前，注射LHRHa和DOM混合物進(jìn)行人工催產(chǎn)，注射劑量為10μg LHRHa+1mg DOM/kg體重，每隔12個(gè)小時(shí)注射1次，雌性鱘魚連續(xù)注射2次，雄性鱘魚注射1次；待親魚有排精/排卵跡象，擠出精液到干燥的燒杯，擠出卵到玻璃平皿；用0.3×Daniea u buffer將精液稀釋100倍，進(jìn)行人工授精；受精時(shí)間1分鐘，隨后洗去多余的精液，即獲得可用于顯微注射的鱘魚受精卵；

所述的Danieau buffer為：17mM NaCl，2mM KCl，0.12mM MgSO₄，1.8mM Ca(NO₃)₂，1.5mMHEPES，pH 7.6。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述的鱘魚包括小體鱘，西伯利亞鱘(A.baerii)、施氏鱘(A.schrenckii)、俄羅斯鱘(A.gueldenstaedtii)。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述的Cas9蛋白與靶基因gRNA的終濃度分別為100ng/μL和30ng/μL。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，每個(gè)受精卵注射體積為2nL。