[發明專利]DNA單分子測序方法與測序系統

有效

• 申請號: 201711280069.4
• 申請日: 2017-12-06
• 公開（公告）號: CN108251516B
• 公開（公告）日: 2021-04-02
• 發明（設計）人: 沈玉梅;邵志峰;譚連江;龔兵;李小衛
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869;C12M1/38;C12M1/36;C12M1/00;C07H19/10;C07H19/14;C09K11/06
• 代理公司: 上海漢聲知識產權代理有限公司 31236
• 代理人: 莊文莉

本發明提供了一種DNA單分子測序方法與測序系統，所述DNA單分子測序方法包括如下步驟：S1對基體表面進行修飾，將水溶性雙功能連接單元連接于基體表面；然后將引物P1與水溶性雙功能連接單元連接，即得固定有引物的基體；S2、將含待測DNA模板、聚合酶、四色熒光標記可逆終止劑的混合溶液置于固定有引物P1的基體上，進行延伸，形成含熒光素的引物/模板復合物；S3、對延伸后的引物/模板復合物進行成像，確定參與延伸的核苷酸堿基種類；S4、將參與延伸的核苷酸的可裂解連接單元斷裂，進行下一次延伸；S5、重復上述步驟S2至步驟S4，獲得待測DNA模板的堿基序列。本發明能夠完美地做到一次測序循環只延伸一個可逆終止劑的效果。

技術領域

本發明涉及基因工程領域，具體地，涉及一種DNA單分子測序方法與測序系統。

背景技術

人類基因組計劃完成后，DNA測序技術得到了迅速發展。DNA測序(DNAsequencing)是指分析特定DNA片段的堿基序列，也就是腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)與鳥嘌呤(G)的排列順序。發展精確、高通量、低成本的DNA測序方法對于生物、醫學等具有重要意義。

DNA合成測序二代測序技術已經得到廣泛應用，但是其內在的局限性也是顯而易見的。比如測序時間長、DNA擴增可能引入一定的錯誤率，定量測量相對復雜等。因此，基于單分子的三代測序技術近年來得到了高度重視和發展，以彌補現行的二代測序技術的局限。

目前，單分子測序技術主要基于兩種不同的原理。一個是通過DNA分子直接穿過適當的納米孔而讀取DNA分子中的堿基信息(Oxford Nanopore)。另一個是通過合成延伸，結合單分子熒光測量來獲取DNA分子中的堿基信息(Helicos與PacificBio)。雖然通過5′-標記熒光技術(PacificBio)可以實現較長的一次性讀取，但其檢測方式復雜，準確度有所不足。通過堿基的合理熒光修飾，結合單堿基延伸與復活，具有較高的準確性。讀取系統相對簡單，可充分利用半導體技術的跳躍式發展，實現高通量、低成本的單分子直接測序而不需通過放大等步驟。而這樣方法的關鍵是實現穩定可靠的單堿基延伸以及檢測后的長期循環延伸，從而實現準確和較長的序列讀取。因此，發展基于這一原理的單分子測序技術具有尤其獨特的優勢，對臨床檢測和基礎研究都具有現實意義和重要性。

目前文獻已經公開的單分子測序方法，最引人注目的是，文獻(Nat.Methods2009，6,593-595.)報道的Virtual terminator nucleotides for next-generation DNAsequencing，在該文獻中，為了在單分子測序中實現一次測序循環只能延伸一個可逆終止劑的目的，設計合成了結構非常復雜的虛擬終止劑，而這樣的結構導致在聚合酶作用下，延伸反應很慢，并且延伸的錯誤率較高。而在此之前，文獻(Science,2008,320,106-109.)報道一次測序循環可延伸一個、兩個甚至三個二硫鍵可逆終止劑，但不能做到一次測序循環只能延伸一個可逆終止劑。

在單分子測序測序中，通過可連接單元將熒光素與核苷酸連接起來形成的可逆終止劑，其電子效應與空間位阻在DNA延伸、斷裂可連接連接單元以便除去熒光素等過程中發揮著極為重要的作用，直接影響甚至決定測序的效率、讀長等關鍵指標。基于二硫鍵連接單元的可逆終止劑在單分子測序中已得到應用，然而文獻(Nucleic Acids Research,2008,36,No.4e25)報道基于二硫鍵的可逆終止劑為單色熒光標記四個不同堿基的核苷酸，Helicos公司為了確保二硫鍵可逆終止劑作為單分子測序試劑一次只延伸一個可逆終止劑，在熒光素旁邊又連接了一個位阻很大的核苷一磷酸以及二膦酸，空間位阻如此大的可逆終止劑的確能夠做到一次只延伸一個，然而其合成路線極為繁雜，過大的位阻同時也造成參與DNA鏈延伸時酶不好識別且速度慢、錯配率高(Michael L.Metzker；Nature ReviewsGenetics 2010,11,31.)。

發明內容

針對現有技術中的缺陷，本發明的目的是提供一種DNA單分子測序系統與測序方法。本發明提供的測序系統與方法也適用于任何DNA、RNA和基因組測序。