[發明專利]DNA單分子測序方法與測序系統

有效

• 申請號: 201711280069.4
• 申請日: 2017-12-06
• 公開（公告）號: CN108251516B
• 公開（公告）日: 2021-04-02
• 發明（設計）人: 沈玉梅;邵志峰;譚連江;龔兵;李小衛
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869;C12M1/38;C12M1/36;C12M1/00;C07H19/10;C07H19/14;C09K11/06
• 代理公司: 上海漢聲知識產權代理有限公司 31236
• 代理人: 莊文莉

1.一種DNA單分子測序方法，其特征在于，包括如下步驟：

S1、對基體表面進行修飾，然后將水溶性雙功能連接單元連接于基體表面；再將引物P1與所述水溶性雙功能連接單元連接，即得固定有引物P1的基體；

S2、將含待測DNA模板、聚合酶、四色熒光標記可逆終止劑的混合溶液置于所述固定有引物P1的基體上，進行延伸，形成含熒光素的引物/模板復合物；

S3、對延伸后的引物/模板復合物進行成像，確定參與延伸的核苷酸堿基種類；

S4、將參與延伸的核苷酸的可裂解連接單元斷裂，進行下一次延伸；

S5、重復上述步驟S2至步驟S4，獲得待測DNA模板的堿基序列；

所述的四色熒光標記可逆終止劑為以下結構中的任意四種不同熒光素標記、不同堿基的可逆終止劑：

所述水溶性雙功能連接單元的一端連接有炔基或者疊氮基，另一端為羧基活性酯；所述水溶性雙功能連接單元的一端以酰胺鍵與基體表面相連，而另一端通過點擊化學反應與引物P1連接；

所述水溶性雙功能連接單元包括以下結構式中的至少一種：

2.根據權利要求1所述的DNA單分子測序方法，其特征在于，所述引物P1為5’-N₃修飾的引物或5’-炔基修飾的引物。

3.根據權利要求1所述的DNA單分子測序方法，其特征在于，步驟S1中，所述修飾步驟包括：

A1、基體表面羥基化：將干凈的基體置于雙氧水和濃硫酸的混合液中，在80-90℃下加熱1h，使基體表面羥基化；

A2、基體表面氨基化：將經步驟A1處理的基體置于溶劑中與氨丙基三乙氧基硅烷在60℃下加熱反應2小時，得到表面帶有氨基的基體。

4.根據權利要求1所述的DNA單分子測序方法，其特征在于，步驟S1中，將所述連接單元連接于基體表面的步驟包括：將基體片置于連接單元的DMF/吡啶溶液中，其中DMF與吡啶的體積比為5:1-10:1，所述連接單元在整個溶液體系中的濃度為10mM～50mM，室溫浸泡后進行超聲處理，真空干燥。

5.根據權利要求1所述的DNA單分子測序方法，其特征在于，步驟S1中，將引物P1與所述連接單元連接的步驟包括：將引物P1溶于DMSO/H₂O中，DMSO與H₂O的體積比為1:3～1:1；取引物P1溶液滴加于基體表面，然后分別滴加碘化亞銅和二異丙基乙胺，兩者的摩爾比為1:1，室溫反應將引物P1連接在基體表面。

6.一種基于權利要求1所述的DNA單分子測序方法的DNA單分子測序系統，其特征在于，包括流通池反應器、流路系統、控制系統、光學系統、檢測系統和圖像數據處理系統；所述流通池反應器與流路系統、控制系統和光學系統分別連接，所述檢測系統一端與光學系統連接，另一端與圖像數據處理系統連接；

所述流通池反應器包括采用水溶性雙功能連接單元連接了引物的基體；

所述控制系統包括pH控制系統、溫度控制系統。

7.一種基于權利要求1所述的DNA單分子測序方法的DNA單分子測序試劑盒，其特征在于，包括基體、引物、水溶性雙功能連接單元、固定引物用反應試劑、延伸反應試劑、酶和pH控制試劑。