[發(fā)明專利]一種精子表面出云蛋白1的定量檢測方法

有效

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• 申請日: 2017-12-06
• 公開（公告）號: CN108152189B
• 公開（公告）日: 2020-06-05
• 發(fā)明（設計）人: 葉英輝;崔龍;曲凡
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: G01N15/14
• 分類號: G01N15/14
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 趙杭麗

本發(fā)明提供一種精子表面出云蛋白1的定量檢測方法，通過精子分離預處理，精子前處理暴露精子Izumo1蛋白表位，使用熒光素標記精子Izumo1蛋白并使用流式細胞儀檢測。本發(fā)明首次利用流式細胞術對人類精子中Izumo1蛋白進行定量檢測，直接實現了對Izumo1蛋白的精確定量，且操作易于標準化，快速準確，精密度高。相對于傳統的細胞免疫熒光，熒光原位雜交等定性或半定量檢測Izumo1蛋白的方法，本發(fā)明方法具有檢測方便，精密度高，速度快等優(yōu)勢，可在定量檢測精子表面Izumo1蛋白表達中的應用，易于推廣，檢測結果可用于對精子受精能力進行輔助評估，適于實用。

技術領域

本發(fā)明屬于細胞生物學領域，涉及一種使用流式細胞術對人類精子表面出云蛋白1 (Izumo1)的定量檢測法方定。

背景技術

在體外受精-胚胎移植(IVF-ET)中，受精率低(30％)和不受精的病例屢有發(fā)生。綜合報道受精失敗(受精率低和不受精)的病例數占總周期數的10％-25％左右，極大的影響了輔助生育技術的治療效果同時也為不孕不育夫婦心理上帶來了嚴重創(chuàng)傷。

受精失敗的原因有精子因素和卵子因素。精子因素主要包括精子透明帶結合或穿透異常，頂體反應缺陷等。如果對因精子因素導致受精失敗的患者采用ICSI方式受精，可以獲得滿意的受精率和臨床妊娠率。

受精是有性生殖的終極事件，由單倍體的精子和卵子創(chuàng)造一個新的，具有遺傳異質性的二倍體子代。精子首先在女性生殖道內需要獲得對卵子受精的能力，即精子獲能。隨后精子發(fā)生頂體反應，將先前隱藏的受體蛋白暴露在表面。伴隨著精卵發(fā)生相互作用，在受精完成后透明帶和卵膜會發(fā)生相應生化改變，使卵母細胞不能再接受其他精子，從而減少多精受精的發(fā)生。在受精過程中，有許多受體蛋白在精卵識別與融合進程中起作用。但在體內，有一對蛋白對受精具有重要作用，即位于精子中的出云蛋白1(Izumo1)和位于卵母細胞中的朱諾蛋白(Juno)，也稱之為葉酸受體4(Folate receptor 4,Folr4)。Izumo1是免疫球蛋白超家族的成員之一，蛋白定位在精子頂體內膜，在精子發(fā)生頂體反應后暴露于內膜表面，并與卵膜上的Juno蛋白結合識別并發(fā)揮作用。Izumo基因敲除研究證明，雄性Izumo-/-小鼠的精子形態(tài)和動力均和野生型小鼠無異，但是在受精過程中，由于缺乏Izumo1精子可以穿透透明帶而不能穿透卵膜，因此不具備受精能力。由此可見精子中Izumo1的表達對受精過程的完成具有重要作用。

通過測定精子中Izumo1蛋白的表達水平可以對精子的受精能力進行評估，從而有助于選擇合適的受精方式，為患者節(jié)約寶貴的治療時間，也避免了由于受精失敗對患者帶來的巨大打擊。

流式細胞術(flow cytometry)是利用流式細胞儀快速準確定量分析細胞群的物理化學特征的技術，可以對細胞的顆粒度，抗原分子表達等情況進行測定。利用流式細胞術對精子表面Izumo1蛋白進行檢測具有快速準確，精密度好等優(yōu)點。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的在于提供一種精子表面出云蛋白1(Izumo1)的定量檢測方法，是應用流式細胞術定量檢測人類精子表面Izumo1蛋白的方法，具體通過以下步驟實現：

(1)精子分離預處理

a.在塑料試管中將三份含有10％血清替代物(synthetic serum substitute)的4-羥乙基哌嗪乙磺酸(Hepes)緩沖人輸卵管液(HTF)以體積比為3：1比例加入一份精液標本中并混勻，

b.以200×g離心力離心5min洗滌精子，移除上清液，再加入HTF液重懸后重復洗滌一次，

c.小心吸除上清液，保留試管底部沉淀精子，并取1ml含有10％血清替代物的G-IVF液小心加在洗滌后的精子上方，

d.將試管45°角斜放入6％二氧化碳，37攝氏度培養(yǎng)箱內培養(yǎng)30min使活力高的精子上游，