[發明專利]一種精子表面出云蛋白1的定量檢測方法

有效

• 申請號: 201711278978.4
• 申請日: 2017-12-06
• 公開（公告）號: CN108152189B
• 公開（公告）日: 2020-06-05
• 發明（設計）人: 葉英輝;崔龍;曲凡
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: G01N15/14
• 分類號: G01N15/14
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 趙杭麗

1. 一種精子表面出云蛋白1的定量檢測方法，包括精子分離預處理和出云蛋白1檢測，其特征在于，具體通過以下步驟實現：

（1）精子分離預處理

a.將三份含有10%血清替代物的4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖人輸卵管液以體積比為3：1比例加入一份精液標本中并混勻，

b.離心5分鐘洗滌精子兩次，

c.吸除上清液，取1ml含有10%血清替代物的G-IVF液小心加在洗滌后的精子沉淀物上方，

d.將試管45°角斜放入培養箱內培養30分鐘使精子上游，

e.將上游后的精子離心5分鐘，取沉淀后的精子放置于37攝氏度培養箱內備用；

（2）分離后精子樣本前處理，暴露出云蛋白1表位

a.取精子前處理反應培養液加入到處理后的精子沉淀中，混勻，并調整精子終濃度為1-5×10⁷/ml，放入6%二氧化碳，37攝氏度培養箱內反應2小時，使精子充分反應，暴露精子出云蛋白1表位；反應培養液的配置：取2ml含有10%血清替代物的人卵裂期胚胎培養液G-1，并加入終濃度為100μM的鈣離子載體A23187，混勻后放入6%二氧化碳，37攝氏度培養箱內平衡8小時；

b.將充分反應后的精子加入1×磷酸緩沖鹽溶液以200×g離心力離心5分鐘，洗滌兩次后用磷酸緩沖鹽溶液重懸備用；

（3）使用流式細胞儀檢測精子出云蛋白1表達情況

a.每例樣本分別設一管實驗管和一管同型對照管，在實驗管和對照管中分別加入500μl洗滌后精子，實驗管中加入1:200倍稀釋的Izumo1多克隆一抗，對照管加等量磷酸緩沖鹽溶液，室溫下孵育1小時，

b.將孵育后的精子使用1×磷酸緩沖鹽溶液洗滌兩遍，

c.在實驗管中加入異硫氰酸熒光素標記的1:400倍稀釋的熒光二抗，在對照管中加入FITC標記的1:400倍稀釋的同型對照抗體，室溫下避光孵育一小時，

d.將孵育后的精子使用1×磷酸緩沖鹽溶液洗滌兩遍，洗去未結合的熒光標記抗體，

e.在實驗管和對照管中加入500μl含有1mg/ml 乙二胺四乙酸的磷酸緩沖鹽溶液重懸樣本后上機檢測，

f.流式細胞儀檢測采用設門法，檢測指標為陽性百分率和平均熒光強度，

g.采用ROC曲線劃定截斷值，計算界定受精能力的精子出云蛋白1陽性百分率。

2.根據權利要求1所述的一種精子表面出云蛋白1的定量檢測方法，其特征在于，所述精子前處理反應培養液中，人卵裂期胚胎培養液G-1用人卵裂期胚胎培養液G-IVF替換。

3.根據權利要求1所述的一種精子表面出云蛋白1的定量檢測方法，其特征在于，所述精子前處理反應培養液中，人卵裂期胚胎培養液G-1用人輸卵管液替換。

4.根據權利要求1所述方法在定量檢測精子表面出云蛋白1表達中的應用。