[發明專利]基于酵母細胞的基因檢測標準品的構建方法及其試劑盒

有效

• 申請號: 201711277328.8
• 申請日: 2017-12-06
• 公開（公告）號: CN108486158B
• 公開（公告）日: 2020-11-17
• 發明（設計）人: 盧大儒;陳紅巖;丁嘉琦;盧德頤
• 申請（專利權）人: 上海澤因生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/90
• 分類號: C12N15/90;C12N9/22;C12Q1/6806
• 代理公司: 上海智力專利商標事務所(普通合伙) 31105
• 代理人: 周濤

本發明涉及一種基于酵母細胞的基因檢測標準品的構建方法及其試劑盒，首次開創性地采用了酵母細胞作為遺傳背景，將待檢測的目的基因，例如人體細胞突變基因，通過同源重組的方式整合到酵母細胞的基因組中，由此獲得的重組酵母細胞可以在針對目的基因的遺傳檢測中作為陽性對照的標準品。

技術領域

本發明涉及一種基于酵母細胞的基因檢測標準品的構建方法及其試劑盒，屬于分子生物學技術領域。

背景技術

在臨床的遺傳診斷中，基因檢測的精確性是十分重要的。以產前檢查為例，假陽性的結果會錯誤的指導患者終止正常的胚胎，假陰性的結果會導致對患病嬰兒的樂觀預期和錯誤診斷。在臨床上，遺傳檢測往往是指導形成診療方案的基礎。越來越多的人利用遺傳檢測來獲得個體在人群中易感幾率，從而采取有效的疾病預防措施，包括介入診療手段和生活方式的改變等。

為了確保遺傳檢測結果的可靠性和準確性，每個實驗必須具備作為陽性對照和陰性對照的遺傳參考物質。

目前較常用的遺傳檢測標準品有如下幾種：

病人樣本；

腫瘤組織樣本(手術切除/穿刺組織，福爾馬林固定/石蠟包埋/冰凍切片/新鮮樣本等)血液樣本(循環腫瘤細胞、游離的腫瘤細胞基因組)；

含遺傳突變的細胞系；

各種遺傳病、腫瘤等永生化細胞系；

細胞遺傳改造(整合插入、定點突變、基因敲除)；

其他細胞背景的基因敲入；

質粒樣品PCR產物：含突變位點及附近序列的重組質粒或PCR產物；

合成DNA樣品；

上述各種類型的遺傳檢測標準品均有其自身的優勢和局限性。例如，臨床病人樣本存在樣本獲取不便、樣品珍貴、均一性不佳、無法大量制備標準品等缺陷；獲得遺傳病細胞系往往通過病人細胞永生化，且永生化細胞株遺傳特性難以長期保持；含腫瘤突變細胞系建株困難且不穩定，含遺傳突變細胞系構建過程繁瑣，需要復雜的篩選過程同時細胞系價格昂貴，培養條件要求較高；質粒樣品構建簡單快速，但體系中質粒拷貝數高，稀釋和模擬基因組DNA及進行較低突變百分率標準品的混合時會造成很大的誤差、易污染。

因此，構建新的基因檢測標準品體系是本領域技術人員亟待解決的問題。

發明內容

鑒于相關技術的上述問題和/或其他問題，本發明一方面提供了一種基因檢測標準品的構建方法，所述構建方法包含將待檢測的目的基因序列通過同源重組的方式插入到酵母細胞的基因組中獲得含有所述目的基因序列的重組酵母細胞；所述重組酵母細胞在針對所述目的基因的檢測中用作陽性對照標準品。

優選的，所述構建方法至少包括構建同源重組模板的步驟，以及將所述同源重組模板轉化所述酵母細胞的步驟；所述同源重組模板包含上游同源修復臂和下游同源修復臂，以及位于所述上游同源修復臂與下游同源修復臂之間的所述目的基因序列；所述同源重組模板中的上游同源修復臂和下游同源修復臂靶向所述酵母細胞的營養缺陷型標記基因。

優選的，所述構建方法還包括基于基因編輯系統來構建靶向所述酵母細胞的營養缺陷型標記基因的基因編輯質粒的步驟；并且，將所述同源重組模板與所述基因編輯質粒一同轉化所述酵母細胞，獲得在所述酵母細胞的營養缺陷型標記基因中插入了所述目的基因序列的重組酵母細胞。

優選的，在所述基于基因編輯系統來構建靶向所述酵母細胞的營養缺陷型標記基因的基因編輯質粒的步驟中：所述基因編輯系統為CRISPR/Cas9基因編輯系統，所述酵母細胞為釀酒酵母，所述營養缺陷型標記基因為URA3基因；其中，所述基因編輯質粒靶向所述釀酒酵母基因URA3并使其DNA雙鏈斷裂的位點為編輯位點；