[發(fā)明專利]基于酵母細(xì)胞的基因檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建方法及其試劑盒

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201711277328.8
• 申請(qǐng)日: 2017-12-06
• 公開（公告）號(hào): CN108486158B
• 公開（公告）日: 2020-11-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 盧大儒;陳紅巖;丁嘉琦;盧德頤
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海澤因生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/90
• 分類號(hào): C12N15/90;C12N9/22;C12Q1/6806
• 代理公司: 上海智力專利商標(biāo)事務(wù)所(普通合伙) 31105
• 代理人: 周濤

1.一種用于遺傳診斷的基因檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建方法，其特征在于：所述構(gòu)建方法包含將待檢測(cè)的目的基因序列通過同源重組的方式插入到酵母細(xì)胞的基因組中獲得含有所述目的基因序列的重組酵母細(xì)胞；

所述重組酵母細(xì)胞經(jīng)原生質(zhì)化處理后，在針對(duì)所述目的基因的檢測(cè)中用作陽性對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品；

所述構(gòu)建方法至少包括構(gòu)建同源重組模板的步驟，以及將所述同源重組模板轉(zhuǎn)化所述酵母細(xì)胞的步驟；

所述同源重組模板包含上游同源修復(fù)臂和下游同源修復(fù)臂，以及位于所述上游同源修復(fù)臂與下游同源修復(fù)臂之間的所述目的基因序列；

所述同源重組模板中的上游同源修復(fù)臂和下游同源修復(fù)臂靶向所述酵母細(xì)胞的營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記基因；

所述構(gòu)建方法還包括基于基因編輯系統(tǒng)來構(gòu)建靶向所述酵母細(xì)胞的營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記基因的基因編輯質(zhì)粒的步驟；并且，

將所述同源重組模板與所述基因編輯質(zhì)粒一同轉(zhuǎn)化所述酵母細(xì)胞，獲得在所述酵母細(xì)胞的營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記基因中插入了所述目的基因序列的重組酵母細(xì)胞。

2.如權(quán)利要求1所述的基因檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建方法，其特征在于：

在所述基于基因編輯系統(tǒng)來構(gòu)建靶向所述酵母細(xì)胞的營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記基因的基因編輯質(zhì)粒的步驟中：所述基因編輯系統(tǒng)為CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)，所述酵母細(xì)胞為釀酒酵母，所述營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記基因?yàn)閁RA3基因；其中，所述基因編輯質(zhì)粒靶向所述釀酒酵母基因URA3并使其DNA雙鏈斷裂的位點(diǎn)為編輯位點(diǎn)；

在所述構(gòu)建同源重組模板的步驟中：首先基于CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)構(gòu)建同源重組載體，所述同源重組載體含有靶向所述編輯位點(diǎn)的上游同源修復(fù)臂和下游同源修復(fù)臂；再將所述目的基因序列通過限制性酶切的分子克隆方法連入到所述同源重組載體中、且位于所述上游同源修復(fù)臂與下游同源修復(fù)臂之間；最后，再通過限制性酶切的方法獲得含有所述上游同源修復(fù)臂、所述目的基因序列和所述下游同源修復(fù)臂的線性化的同源重組模板；

在將獲得的所述基因編輯質(zhì)粒與所述線性化的同源重組模板一同轉(zhuǎn)化釀酒酵母細(xì)胞，獲得在URA3基因中插入了所述目的基因序列的重組釀酒酵母細(xì)胞；

所述構(gòu)建基因編輯質(zhì)粒的步驟與所述構(gòu)建同源重組模板的步驟各自獨(dú)立完成，不分先后。

3.如權(quán)利要求2所述的基因檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建方法，其特征在于：

在所述構(gòu)建基因編輯質(zhì)粒的步驟中，將靶向釀酒酵母基因URA3的gRNA通過限制性酶切的分子克隆方法連接到酵母-大腸桿菌穿梭型載體中，獲得所述基因編輯質(zhì)粒；

所述靶向釀酒酵母基因URA3的gRNA的序列如SEQ ID No.1所示。

4.如權(quán)利要求3所述的基因檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建方法，其特征在于：

在所述構(gòu)建基因編輯質(zhì)粒的步驟中，擴(kuò)增所述gRNA的引物對(duì)序列如SEQ ID No.2和SEQID No.3所示；所述酵母-大腸桿菌穿梭型載體為p425-Sap-TEF1p-Cas9-CYC1t-2xSap載體；將SapI酶切過的p425-Sap-TEF1p-Cas9-CYC1t-2xSap載體與所述gRNA連接，將獲得的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，選取經(jīng)鑒定的陽性克隆進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，經(jīng)質(zhì)粒提取和純化操作獲得所述基因編輯質(zhì)粒。

5.如權(quán)利要求3所述的基因檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建方法，其特征在于：

在所述構(gòu)建同源重組模板的步驟中，基于如SEQ ID No.4所示的URA3基因序列中第351-373位的上游序列設(shè)計(jì)所述上游同源修復(fù)臂，基于于如SEQ ID No.4所示的URA3基因序列中第351-373位的下游序列設(shè)計(jì)所述下游同源修復(fù)臂。

6.如權(quán)利要求5所述的基因檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建方法，其特征在于：

所述上游同源修復(fù)臂的序列如SEQ ID No.5所示；所述下游同源修復(fù)臂的序列如SEQID No.6所示。