[發(fā)明專利]一種用于同時檢測三種禽病毒病的高通量試劑盒及其檢測方法和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201711276794.4
• 申請日: 2017-12-06
• 公開（公告）號: CN108085413B
• 公開（公告）日: 2021-09-21
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 周繼勇;閆麗萍;肖倩;雷靜
• 申請（專利權(quán)）人: 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12Q1/6837;C12R1/93
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責(zé)任公司 32218
• 代理人: 徐冬濤;李曉峰

本發(fā)明公開一種用于檢測三種禽病毒病的高通量試劑盒及其檢測方法和應(yīng)用，本發(fā)明提供的基因芯片方法檢測NDV、IBV和AIV及其H5、H7、H9亞型流感病毒核酸檢測試劑盒，其檢測更加快速、敏感性更高、操作簡便。本研究開發(fā)的是NDV、IBV和AIV及其H5、H7、H9亞型流感病毒核酸同時檢測的試劑盒，能夠在實際生產(chǎn)中快速診斷雞群是否感染上述的檢測的病毒、監(jiān)測雞群的發(fā)病情況。為臨床上NDV、IBV和AIV及其H5、H7、H9亞型流感的大規(guī)模病毒監(jiān)測、流行病學(xué)調(diào)查以及上述疾病的防控提供了一種新的、有效的檢測手段。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)檢測方法領(lǐng)域，具體涉及用于同時檢測NDV、IBV和AIV及其H5、H7、H9亞型流感病毒的試劑盒及其檢測方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

禽流感(avian influenza，AI)是由正黏病毒科流感病毒屬的A型流感病毒(AIV)引起的一種禽類或人類感染的傳染病。根據(jù)AIV的血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)抗原差異，AIV可分為16個HA亞型(H1～H16)和9個NA亞型(N1～N9)，在家禽中，主要流行的是H9N2、H5N1以及H7N3亞型流感病毒。新城疫（Newcastle disease ，ND）是又稱亞洲雞瘟，是由禽副流感病毒型新城疫病毒(NDV)引起的一種主要侵害雞、火雞、野禽及觀賞鳥類的高度接觸傳染性、致死性疾病，有強(qiáng)毒株和弱毒株兩類，主要特征是呼吸困難、便稀、神經(jīng)紊亂、粘膜和漿膜出血。死亡率高，對養(yǎng)禽業(yè)危害嚴(yán)重。雞的傳染性支氣管炎（Infectious bronchitis,IB）是由傳染性支氣管炎病毒（Infectious bronchitis Virus, IBV）引起的雞急性、高度接觸性的呼吸道和生殖道傳染病，雞傳染性支氣管炎病毒具有多種血清型和多組織嗜性。這些禽類疾病對養(yǎng)禽業(yè)的能造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展在很大程度上取決于疾病的診斷和控制，所以能同時區(qū)分IBV、NDV和AIV及其H5、H7和H9亞型流感病毒是很重要的。

基因芯片技術(shù)的方法敏感性高、時間短。禽流感病毒具有16種HA亞型和9種NA亞型，AIV、NDV、IBV對養(yǎng)禽業(yè)的危害巨大，在臨床上快速鑒定和診斷是非常必要的。

本研究將進(jìn)行的是同時鑒定出IBV、NDV和AIV及其H5、H7和H9病毒的亞型類別，基于iPDMS（initiator integrated poly (dimethysiloxane), iPDMS）為基因芯片膜，進(jìn)行以上病毒的核酸檢測的診斷方法還未見報道。。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是，克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種用于檢測NDV、IBV和AIV及其H5、H7、H9亞型流感病毒的試劑盒及其檢測方法和應(yīng)用。該試劑盒采用基因芯片方法可同時檢測NDV、IBV和AIV及其H5、H7、H9亞型流感病毒，為臨床上述禽病的診斷和抗體水平的檢測提供經(jīng)濟(jì)實用可靠的檢測工具。檢測敏感性高、特異性和重復(fù)性好；試劑盒檢測樣本的價格便宜；檢測時間短且結(jié)果易觀察。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的解決方案是：

一種用于同時檢測NDV、IBV和AIV及其H5、H7、H9亞型流感病毒的試劑盒，該試劑盒包括：

（1）用探針制備的基因芯片；

（2）洗液1：20×SSC；

（3）洗液2：10%SDS；

（4）洗液3：1M檸檬酸鈉；

（5）正向引物和反向引物；

（6）POD(Streptavidin-Horseradish Peroxidase)；

（7）一步法多重RT-PCR試劑，其中包含：2×One Step Q Probe Mix、One Step QProbe Enzyme Mix和RNase-free water；

（8）陽性對照樣品；