[發明專利]一種檢測金龍膠囊中蘄蛇成分的質量控制方法

在審

• 申請號: 201711276724.9
• 申請日: 2017-12-06
• 公開（公告）號: CN108118095A
• 公開（公告）日: 2018-06-05
• 發明（設計）人: 晁志;葉浩婷;田恩偉
• 申請（專利權）人: 南方醫科大學
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/6806;C12Q1/686;C12N15/10
• 代理公司: 廣州新諾專利商標事務所有限公司 44100
• 代理人: 周端儀;劉婉

本發明提供了一種檢測金龍膠囊中蘄蛇成分的質量控制方法，其步驟如下：提取金龍膠囊樣品中的DNA；設計并合成Taqman探針；建立Taqman qPCR標準曲線；進行Taqman qPCR檢測。本發明的方法能夠準確、可靠、有效地鑒定金龍膠囊中的蘄蛇成分。

技術領域

本發明屬于分子生物學領域，具體涉及一種基于Taqman探針的qPCR檢測金龍膠囊中蘄蛇成分的質量控制方法。

背景技術

金龍膠囊是國家批準的首例抗癌鮮動物藥，其組方由鮮守宮、鮮金錢白花蛇、鮮蘄蛇按2：1：1的比例組成，具有破瘀散結、解郁通絡的功效，可抑制腫瘤生長、抑制術后局部復發和遠處轉移、調節機體免疫，用于原發性肝癌、肺癌等癌癥治療及放化療輔助治療。其中，蘄蛇是一種貴重的中藥材，具有祛風、通絡、止痙的功效。近年來，蛇的藥用價值和經濟價值明顯提高，社會需求持續上升。隨著蛇類野生資源逐漸匱乏，加上價格昂貴，藥材市場上出現偽品及混淆品甚多，質量問題嚴重，僅根據外部形態特征很難進行準確地鑒別。此外由于蛇類本身繁殖能力不強，加之生態環境易遭破壞，偷獵、走私與濫用導致多種蛇類特別是瀕危蛇類的生存受到威脅。對蛇的準確鑒定，不僅能準確的鑒別藥材正品與混淆品，保證用藥的安全有效，也是加強蛇類資源保護與管理的首要環節。

在中藥的發展過程中，動物藥是其中的重要組成部分。由于動物藥本身化學成分復雜，化合物分離分析難度大，在專屬性鑒別和含量測定研究方面相比于植物藥略顯遜色。基于化學成分層面的定性定量分析方法，只有少數動物藥有專屬性強的質量控制方法，如斑蝥可以利用高校液相色譜法對其專有的斑蝥素成分進行定量分析檢測。然而，羚羊角、鹿茸、海馬等絕大多數動物藥主要基于鑒別其真偽，且沒有特有的化學成分，常用的鑒別方法專屬性不高。隨著分子生物技術的發展，對于中藥，特別是動物藥，用分子手段可以實現對化學成分不明確或者沒有專有化學成分的高特異性鑒別。中國藥典2015版蘄蛇鑒別項下使用的是常規PCR方法，首先提取其DNA，再利用特異性引物擴增目的片段。這種方法特異性強，不會出現假陽性，但是只能夠進行定性鑒別。然而由于金龍膠囊制品中DNA降解和片段化較為嚴重，常規的提取方法很難成功的提取出質量好的DNA，這樣就很難擴增出目的片段，出現假陰性。對于絕大多數動物類中藥，目前還沒有有效可靠、適用性廣的質量控制方法。

實時熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)是一種在DNA擴增反應中，以熒光化學物質檢測每次聚合酶鏈式反應(PCR)循環后產物總量的方法。通過內參或者外參法對待測樣品中的特定DNA序列進行定性定量分析的方法。該方法通過熒光信號的分析，對PCR進程進行實時檢測。探針法是qPCR中的一種常見方法，在反應體系中加入化學修飾的寡聚核苷酸探針。探針完整時，報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收，無法檢測到熒光信號。而當PCR擴增時，Taq DNA酶的5’-3’端外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，熒光報告基團和淬滅基團間的能量傳遞結構被破壞，從而熒光檢測系統可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與PCR產物的形成完全同步。

發明內容

本發明的目的是針對以上要解決的技術問題，利用分子手段，提供一種方便、快捷、準確、特異性好、靈敏度高、重復性好的質量控制新方法，能夠定量檢測金龍膠囊中的蘄蛇成分。

為了實現上述目的，本發明采用以下技術方案：

一種定量檢測金龍膠囊中蘄蛇成分的方法，其步驟如下：

(1)提取金龍膠囊樣品中的DNA；

(2)設計并合成Taqman探針；

(3)建立Taqman qPCR標準曲線；

(4)進行Taqman qPCR檢測。