[發明專利]一種檢測金龍膠囊中蘄蛇成分的質量控制方法

在審

• 申請號: 201711276724.9
• 申請日: 2017-12-06
• 公開（公告）號: CN108118095A
• 公開（公告）日: 2018-06-05
• 發明（設計）人: 晁志;葉浩婷;田恩偉
• 申請（專利權）人: 南方醫科大學
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/6806;C12Q1/686;C12N15/10
• 代理公司: 廣州新諾專利商標事務所有限公司 44100
• 代理人: 周端儀;劉婉

1.一種檢測金龍膠囊中蘄蛇成分的質量控制方法，其特征在于步驟如下：

(1)提取金龍膠囊樣品中的DNA；

(2)設計并合成Taqman探針；

(3)建立Taqman qPCR標準曲線；

(4)進行Taqman qPCR檢測。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(1)中，采用改良的SDS提取方法進行DNA提取。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，用于DNA提取的試劑包括緩沖液A、緩沖液B和緩沖液C，其中所述緩沖液A包括1M Tris-HCL、5M NaCL、0.5M EDTA和十二烷基硫酸鈉，所述緩沖液B包括3mol/L醋酸鈉，所述緩沖液C包括2mg/mL蛋白酶K。

4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述步驟(1)的提取操作如下：取2粒金龍膠囊內容物，加入2ml所述緩沖液A、100μL所述緩沖液C，充分振蕩混勻，65℃水浴1.5h，加入500μL所述緩沖液B、2mL成分比例為24：1的氯仿-異戊醇抽提，上清液加入等體積異戊醇-20℃沉淀3小時，12000rpm離心20min，用75％乙醇洗滌沉淀，晾干，加入TE溶解，純化DNA。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中，根據蘄蛇特異性引物設計并合成Taqman探針，所述Taqman探針的5’端熒光修飾有報告基團，3’端修飾有淬滅基團；報告基團為FAM、HEX、TAMRA、ROX、CY5中的一種，淬滅基團為Dabcyl、BHQ1、BHQ2中的一種。

6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述Taqman探針的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

7.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述蘄蛇特異性引物的核苷酸序列如SEQID NO.2和SEQ ID NO.3所示。

8.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)包括制備標準品，其中將從蘄蛇肌肉組織提取出來的DNA用Cytb序列通用引物擴增；反應體系為：PCR Taq預混酶20μL、上下游引物各2μL且終濃度為200nmol/L、去離子水12μL、模板4μL，反應總體積為40μL；反應條件為：94℃5min；94℃30s，53℃60s，72℃60s，共35個循環；72℃7min；純化蘄蛇Cytb片段PCR產物并將其作為標準品經測序鑒定，測定標準品DNA濃度和純度，將標準品用去離子水進行10倍比梯度稀釋，以稀釋后的標準品作為模板，進行實時熒光定量PCR建立標準曲線。

9.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(4)中，反應體系為：DNA模板2μL，探針0.2μL，上下游引物各0.4μL且終濃度為200nmol/L，Bester qPCR MasterMix Taqman10μL，ROX 50×0.2μL，去離子水6.8μL，反應總體積為20μL。

10.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(4)中，PCR反應程序為：95℃預變性2min；95℃變性10s，50℃退火30s，72℃延伸30s，共40個循環，在每個循環延伸結束時采集熒光信號。