[發明專利]一種CAV-1基因缺失斑馬魚及其制備方法

在審

• 申請號: 201711273893.7
• 申請日: 2017-12-06
• 公開（公告）號: CN108148873A
• 公開（公告）日: 2018-06-12
• 發明（設計）人: 呂志平;高磊;劉強;黃鵬;林海燕;周振婷;周楚瑩
• 申請（專利權）人: 南方醫科大學
• 主分類號: C12N15/90
• 分類號: C12N15/90;C12Q1/6888;A01K67/027
• 代理公司: 廣州新諾專利商標事務所有限公司 44100
• 代理人: 周端儀

本發明提供一種CAV?1基因缺失斑馬魚突變體及其制備方法，CAV?1基因缺失斑馬魚突變體的構建是通過CRISPR/Cas9技術實現的。本發明的突變體模型可用于研究CAV?1基因在腫瘤發生和遠端轉移過程中的作用。

技術領域

本發明涉及分子生物學領域，涉及一種基因敲除的斑馬魚突變體，具體涉及CAV-1基因缺失斑馬魚突變體及其制備方法。

背景技術

成簇規律間隔回文重復序列CRISPR(Clustered Regularly Interspaced ShortPalind-romic Repeats)和CRISPR相關核酸酶Cas(CRISPR-associated nuclease)系統是細菌和古細菌在長期演化過程中形成的一種適應性免疫防御機制。該系統能夠識別自身序列和外源入侵DNA 片段，并剪切掉外源片段，從而達到保護自己的目的?？茖W家將這種免疫機制開發成為一種基因定點編輯技術，廣泛應用于生物學和醫學研究，目前最常見的基因編輯技術為 CRISPR/Cas9系統。該系統通過向導RNA(single guide RNA,sgRNA)序列，一方面特異識別靶序列，另一方面引導Cas9蛋白定點切割靶位點，使DNA靶位點形成雙鏈缺口，細胞通過同源重組修復或者非同源性末端連接對斷裂的DNA進行修復，從而實現基因的編輯。

Caveolae結構細胞質膜向內凹陷所形成的囊泡狀結構，參與細胞內外物質轉運和細胞信號傳導過程。微囊蛋白-1(Caveolin-1)是Caveolae結構的主要成分，對許多關鍵信號分子的活性狀態起直接調節作用。有研究表明，Caveolin-1與腫瘤的發生與遠處轉移、癌細胞的轉化等過程相關。CAV-1基因是編碼Caveolin-1蛋白的DNA序列，可以通過對CAV-1基因進行定點編輯，從而研究Caveolin-1蛋白在腫瘤中的具體作用，以實現治療疾病的目的。

斑馬魚具有生長發育快，繁殖周期短、子代數量多、體外受精、胚胎透明等生物學特性，十分適合進行基因編輯。構建CAV-1基因突變斑馬魚作為疾病模型，能深入探究CAV-1基因與相關疾病的聯系及發生機制，為靶向藥物的篩選提供一種穩定可靠的模式生物。

發明內容

基于此，本發明的目的在于，提供一種CAV-1基因缺失斑馬魚及其制備方法。

為了實現上述目的，本發明采用了如下技術方案：

一種CAV-1基因敲除方法，其過程包括，設計識別CAV-1基因靶位點的sgRNA序列，所述的sgRNA序列與核酸酶結合并引導核酸酶結合到CAV-1基因靶位點處，核酸酶對靶位點處的序列進行隨機剪切，通過細胞自身的非同源末端連接修復機制修復CAV-1基因雙鏈，造成移碼突變，完成CAV-1基因被敲除。

進一步地，所述的sgRNA序列具有序列表中SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；所述的核酸酶為Cas9蛋白。

進一步地，所述的SEQ ID NO:1記載的核苷酸序列含有HaeⅡ酶切位點；所述的SEQID NO:2記載的核苷酸序列含有StyⅠ酶切位點。

本發明所述的CAV-1基因缺失斑馬魚突變體的制備方法，包括以下步驟：

1)設計識別CAV-1基因靶位點的sgRNA序列，所述的sgRNA序列具有序列表中SEQID NO:1或SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；

2)將所述的sgRNA序列和Cas9mRNA共同顯微注射到斑馬魚胚胎中，然后對得到的斑馬魚胚胎進行培養，得到所述的CAV-1基因缺失斑馬魚突變體。

進一步地，所述步驟1)具體包括：查詢斑馬魚CAV-1基因序列及功能結構域，結合CRISPR/Cas9敲除原理，設計并合成包含sgRNA序列的引物序列，然后通過PCR擴增得到大量雙鏈sgRNA序列，接著通過體外轉錄雙鏈sgRNA序列得到單鏈sgRNA序列。