[發明專利]一種CAV-1基因缺失斑馬魚及其制備方法

在審

• 申請號: 201711273893.7
• 申請日: 2017-12-06
• 公開（公告）號: CN108148873A
• 公開（公告）日: 2018-06-12
• 發明（設計）人: 呂志平;高磊;劉強;黃鵬;林海燕;周振婷;周楚瑩
• 申請（專利權）人: 南方醫科大學
• 主分類號: C12N15/90
• 分類號: C12N15/90;C12Q1/6888;A01K67/027
• 代理公司: 廣州新諾專利商標事務所有限公司 44100
• 代理人: 周端儀

1.一種CAV-1基因敲除方法，其特征在于，設計識別CAV-1基因靶位點的sgRNA序列，所述的sgRNA序列與核酸酶結合并引導核酸酶結合到CAV-1基因靶位點處，核酸酶對靶位點處的序列進行隨機剪切，通過細胞自身的非同源末端連接修復機制修復CAV-1基因雙鏈，造成移碼突變，完成CAV-1基因被敲除。

2.根據權利要求1所述的CAV-1基因敲除方法，其特征在于，所述的sgRNA序列具有序列表中SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；所述的核酸酶為Cas9蛋白。

3.根據權利要求2所述的CAV-1基因敲除方法，其特征在于，所述的SEQ ID NO:1記載的核苷酸序列含有HaeⅡ酶切位點；所述的SEQ ID NO:2記載的核苷酸序列含有StyⅠ酶切位點。

4.一種CAV-1基因缺失斑馬魚突變體的制備方法，其特征在于，所述的制備方法包括以下步驟：

1)設計并合成識別CAV-1基因靶位點的sgRNA序列，所述的sgRNA序列具有序列表中SEQID NO:1或SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；

2)將所述的sgRNA序列和Cas9mRNA共同顯微注射到斑馬魚胚胎中，然后對得到的斑馬魚胚胎進行培養，得到所述的CAV-1基因缺失斑馬魚突變體。

5.根據權利要求4所述的CAV-1基因缺失斑馬魚突變體的制備方法，其特征在于，所述步驟1)具體包括：查詢斑馬魚CAV-1基因序列及功能結構域，結合CRISPR/Cas9敲除原理，設計并合成包含sgRNA序列的引物序列，然后通過PCR擴增得到大量雙鏈sgRNA序列，接著通過體外轉錄雙鏈sgRNA序列得到單鏈sgRNA序列。

6.根據權利要求5所述的CAV-1基因缺失斑馬魚突變體的制備方法，其特征在于，所述的引物序列具有序列表中SEQ ID NO:3或者SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列，以及具有序列表中SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列。

7.根據權利要求4所述的CAV-1基因缺失斑馬魚突變體的制備方法，其特征在于，步驟2)中，所述的Cas9mRNA來自于pGH-T7-zCas9質粒，XbaⅠ酶切pGH-T7-zCas9質粒得到Cas9DNA雙鏈，然后通過體外轉錄Cas9DNA雙鏈得到Cas9mRNA單鏈。

8.根據權利要求4所述的CAV-1基因缺失斑馬魚突變體的制備方法，其特征在于，步驟2)中，所述的斑馬魚胚胎為單細胞期胚胎，顯微注射劑量為2nL；其中，sgRNA的注射濃度為300ng/μL，Cas9mRNA的注射濃度為120ng/μL。

9.一種CAV-1基因缺失斑馬魚突變體的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：以待檢測的斑馬魚基因組DNA為模板，PCR擴增含有權利要求2中所述的sgRNA序列的DNA片段，然后HaeⅡ或者StyⅠ酶切該DNA片段，實現CAV-1基因缺失斑馬魚突變體的檢測。

10.根據權利要求9所述的CAV-1基因缺失斑馬魚突變體的檢測方法，其特征在于：所述PCR擴增的引物序列具有序列表中SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列，或者具有序列表中SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列。