[發明專利]一對用于神經節苷脂定量篩查的浮力微球探針及制備方法

有效

• 申請號: 201711272434.7
• 申請日: 2017-12-01
• 公開（公告）號: CN109870433B
• 公開（公告）日: 2021-06-15
• 發明（設計）人: 鞠熀先;陳云龍;劉惠普
• 申請（專利權）人: 南京大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明涉及一對用于細胞表面神經節苷脂定量篩查的浮力微球探針及其制備方法。該浮力微球探針包含提取探針和收集探針。提取探針以馬來酰亞胺修飾的二氧化硅浮力微球為基底，在其上共價結合具有核酸內切酶切割位點和硼酸末端的DNA分子。通過硼酸與細胞表面唾液酸的共價識別作用，提取探針可以將細胞表面包含唾液酸的生物分子通過浮力提取。在核酸內切酶的作用下，被提取的生物分子可以被釋放到溶液中，并由十八烷硅烷化的收集探針通過疏水作用收集其中的結合有核酸碎片的神經節苷脂，進一步利用體外雜交鏈反應對神經節苷脂進行熒光定量。

一、技術領域

本發明涉及一對用于細胞表面神經節苷脂定量篩查的浮力微球探針及其制備方法。

二、背景技術

神經節苷脂是一種包含一個或多個唾液酸末端寡糖鏈的鞘糖脂。它們通過神經酰胺部分的烷烴鏈嵌在細胞膜上，調節細胞結構，細胞粘附和信號傳導，同時作為微生物毒素、細菌和病毒的受體位點。細胞表面的神經節苷脂通過對應的高特異性的酶以增加或減少糖單元的方式不斷地被合成和降解。其異常的糖基化生物通路與一些疾病相關，如遺傳性疾病和癌癥的惡性轉化。不同亞類的神經節苷脂的異常過表達還與腫瘤的類型和進程密切相關。因此，篩查細胞表面的神經節苷脂對揭示其相關的生物過程和潛在的腫瘤進程具有重要的意義。

為了實現對細胞表面神經節苷脂的定量檢測，該專利制備了一對功能化的浮力微球探針，實現了對細胞表面神經節苷脂的非破壞性定量篩查。

三、發明內容

本發明的目的是：基于硼酸介導的共價識別細胞表面唾液酸和十八烷基分子介導的疏水作用，分別設計了包含核酸切割酶位點和硼酸末端的提取探針和包含十八烷基分子的收集探針。利用提取探針非破壞性地提取細胞表面含唾液酸的生物分子，并通過核酸切割酶將提取物釋放到溶液中。再利用收集探針收集釋放物中的脂類物質，即神經節苷脂，通過神經節苷脂上結合的核酸片段進行雜交鏈反應，獲得可供定量的熒光信號。以MCF-7乳腺癌細胞系為模型，制備的探針實現了對細胞表面神經節苷脂的定量。

本發明提出的可對細胞表面神經節苷脂定量篩查的浮力微球探針如圖1所示。以羥基化的二氧化硅浮力微球為載體，在其表面逐步進行氨基硅烷化，組裝琥珀酰亞胺和馬來酰亞胺雙修飾聚乙二醇連接體，在進一步修飾具有氨基苯硼酸末端和核酸內切酶位點的功能DNA 分子，得到提取探針；直接對羥基化的二氧化硅浮力微球進行十八烷硅烷化，得到收集探針。

本發明通過以下技術方案來實現：

1)含有核酸內切酶位點的DNA分子由DNA1和DNA2雜交形成。DNA1的5’端修飾有羧基，用于共價偶聯氨基苯硼酸；3’端修飾有巰基，用于共價連接到浮力微球上的馬來酰胺基團。

2)提取探針以羥基化的浮力微球為載體，先進行氨基硅烷化，再共價修飾馬來酰胺基團，最后共價組裝上含有核酸內切酶位點的DNA分子；收集探針通過直接對羥基化的浮力微球進行十八烷硅烷化獲得，如圖1所示。

本發明的工作原理：

本發明的工作原理如圖2所示：首先將提取探針與細胞在垂直旋轉儀上孵育，并間歇性離心。循環若干次后在離心作用下通過浮力將提取探針與細胞分離。然后將提取探針與核酸內切酶孵育，將被提取的含唾液酸基團的生物分子酶切，連同結合的核酸碎片釋放到溶液中。通過浮力去除提取探針后，向釋放物溶液中加入收集探針。在垂直旋轉儀上孵育一段時間后，通過浮力分離收集探針；向收集探針分散液中加入雜交鏈反應的引發DNA和一對發夾DNA，進行雜交鏈反應，獲得熒光信號。利用標準的神經節苷脂溶液獲得標準曲線，對細胞表面神經節苷脂進行定量檢測。

與現有技術相比，本發明具有以下特點：

本發明使用的浮力微球與細胞尺寸接近，具有快速浮力分離能力和易于修飾的特點。制備的提取探針可以高效快速地與細胞進行作用和分離，實現對細胞表面神經節苷脂非破壞性的提取。制備的收集探針可通過疏水作用對釋放的神經節苷脂進行特異性收集，并進一步利用雜交鏈反應獲得靈敏的熒光信號，實現細胞表面神經節苷脂的定量檢測。