[發明專利]一種金邊土鱉快速鑒別方法

有效

• 申請號: 201711267988.8
• 申請日: 2017-12-05
• 公開（公告）號: CN107828900B
• 公開（公告）日: 2019-03-19
• 發明（設計）人: 孫冬梅;胥愛麗;畢曉黎;陳昭;李素梅;李養學;江潔怡;陳偉韜;張靖年
• 申請（專利權）人: 廣東省第二中醫院（廣東省中醫藥工程技術研究院）
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/686
• 代理公司: 東莞市興邦知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 44389
• 代理人: 蔡喜玉

本發明公開了一種金邊土鱉快速鑒別方法，通過針對金邊土鱉的特征引物的聚合酶鏈式反應，對金邊土鱉進行快速鑒別。利用PCR法對金邊土鱉的DNA序列進行分析，找出其中的特異性位點，從物種的分子水平上對金邊土鱉進行鑒定，能夠準確、快速、有效地區分金邊土鱉及其同屬動物的混淆品。本發明金邊土鱉快速鑒別方法能夠簡單、準確、直接地鑒別金邊土鱉，只需微量的用量即可檢測，并具有靈敏度高，穩定性好，特異性強的特點，用于制藥過程中金邊土鱉藥材快速質量控制。

技術領域

本發明涉及藥材鑒別領域，具體涉及一種金邊土鱉快速鑒別方法。

背景技術

金邊土鱉為昆蟲綱蜚蠊目姬蠊科昆蟲金邊土鱉Opisthoplatia rientalis Burm干燥蟲體，具有破血逐瘀、續筋接骨的功效。

由于臨床用量不斷增加，國內市場需求量持續加大，導致偽劣混雜，不法商人以次充好，以假亂真。其中同屬動物地鱉、冀地鱉和東方潛龍虱是最常見的混淆品，這些品種成分相似，經打粉入藥后，僅僅靠傳統的形態分析已難以辨認。

而現行地方中藥材標準中收載的金邊土鱉的薄層鑒別方法，是對其氨基酸類成分進行鑒別，專屬性差，無法將地鱉、冀地鱉和東方潛龍虱等混淆品和金邊土鱉有效地區分開來。

發明內容

為了解決上述問題，本發明公開了一種金邊土鱉快速鑒別方法。

利用PCR法對金邊土鱉的DNA序列進行分析，找出其中的特異性位點，從物種的分子水平上對金邊土鱉進行鑒定，能夠準確、快速、有效地區分金邊土鱉及其同屬動物的混淆品。

本發明為實現上述目的所采用的技術方案是：

一種金邊土鱉快速鑒別方法，通過針對金邊土鱉的特征引物的聚合酶鏈式反應，對金邊土鱉進行快速鑒別。

其包括以下步驟：

步驟一、將收集的各批供試藥材分別取總DNA；

步驟二、取特征引物P3，P4加無菌水稀釋；

步驟三、通過PCR反應程序獲得擴增產物；

步驟四、擴增產物與6×Loading buffer混勻后點于瓊脂糖凝膠上，置于紫外燈下觀察，拍照并保存；

步驟五、照片中顯示正品金邊土鱉在250bp～500bp之間有一條清晰條帶，其他混淆品在該位置均無條帶，陰性無干擾。

所述步驟一中，將各批供試藥材，經75％乙醇擦拭表面，晾干，用研缽研磨成粉末，取研碎后的粉末25mg，用DNeasy Blood&Tissue Kit提取試劑盒提取試劑盒提取總DNA，備用。

所述步驟二中，取特征引物P3 5'-CTGGCTGAGGGTCG-3'，P45'-ATCTGGGGGGTATG-3'加無菌水稀釋成10μmol/μL，備用。

所述步驟三中，PCR擴增：50μl體系中含有濃度為10μmol的P3、P4上下游引物各1μL，模板DNA 2μL，Prime STAR HS(Premix)聚合酶預混體系25μL，剩余體積用無菌蒸餾水補足。

所述步驟四中，取擴增產物5μL，與6×Loading buffer 1.0μL混勻后點于0.75％瓊脂糖凝膠上，用1×TAE電泳緩沖液在90V電壓恒壓電泳30min；取出凝膠，置于紫外燈下觀察，并用CAMAG成像系統拍照并保存。

PCR反應程序為：94℃預變性5min；94℃變性30s，61℃退火15s，72℃延伸45s，35個循環；72℃延伸10min；獲得擴增產物。

其還包括以下步驟：