[發明專利]一種金邊土鱉快速鑒別方法

有效

• 申請號: 201711267988.8
• 申請日: 2017-12-05
• 公開（公告）號: CN107828900B
• 公開（公告）日: 2019-03-19
• 發明（設計）人: 孫冬梅;胥愛麗;畢曉黎;陳昭;李素梅;李養學;江潔怡;陳偉韜;張靖年
• 申請（專利權）人: 廣東省第二中醫院（廣東省中醫藥工程技術研究院）
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/686
• 代理公司: 東莞市興邦知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 44389
• 代理人: 蔡喜玉

1.一種金邊土鱉快速鑒別方法，其特征在于：通過針對金邊土鱉的特征引物的聚合酶鏈式反應，對金邊土鱉進行快速鑒別；

其包括以下步驟：

步驟一、將收集的各批供試藥材分別取總DNA；

步驟二、取特征引物P3，P4加無菌水稀釋；

步驟三、通過PCR反應程序獲得擴增產物；

步驟四、擴增產物與6×Loading buffer混勻后點于瓊脂糖凝膠上，置于紫外燈下觀察，拍照并保存；

步驟五、照片中顯示正品金邊土鱉在250 bp~500bp之間有一條清晰條帶，其他混淆品在該位置均無條帶，陰性無干擾；

所述步驟二中，取特征引物P3 5'-CTGGCTGAGGGTCG-3'，P4 5'-ATCTGGGGGGTATG-3'加無菌水稀釋成10μmol/μL，備用。

2. 根據權利要求1所述的金邊土鱉快速鑒別方法，其特征在于，所述步驟一中，將各批供試藥材，經75%乙醇擦拭表面，晾干，用研缽研磨成粉末，取研碎后的粉末25mg，用DNeasyBlood ＆Tissue Kit提取試劑盒提取試劑盒提取總DNA，備用。

3. 根據權利要求1所述的金邊土鱉快速鑒別方法，其特征在于，所述步驟三中，PCR擴增：50μl體系中含有濃度為10μmol的P3、P4上下游引物各1μL，模板DNA 2μL，Prime STAR HS(Premix)聚合酶預混體系25μL，剩余體積用無菌蒸餾水補足。

4. 根據權利要求1所述的金邊土鱉快速鑒別方法，其特征在于，所述步驟四中，取擴增產物5μL，與6×Loading buffer 1.0μL混勻后點于0.75%瓊脂糖凝膠上，用1×TAE電泳緩沖液在90V電壓恒壓電泳30min；取出凝膠，置于紫外燈下觀察，并用CAMAG成像系統拍照并保存。

5. 根據權利要求1或3所述的金邊土鱉快速鑒別方法，其特征在于，PCR反應程序為：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，61℃退火15 s，72℃延伸45 s，35個循環；72℃延伸10 min；獲得擴增產物。

6.根據權利要求1所述的金邊土鱉快速鑒別方法，其特征在于，其還包括以下步驟：

步驟六、對步驟一至步驟五進行耐用性考察，分別考察方法的重復性和DNA聚合酶對該金邊土鱉快速鑒別方法的影響，分別取同一批樣品重復進行6次試驗、更換DNA聚合酶為Taq聚合酶。

7. 根據權利要求6所述的金邊土鱉快速鑒別方法，其特征在于，所述步驟六中， Taq聚合酶PCR體系：50 μL體系中含有濃度為10 μmol的P3、P4上下游引物各1 μL，模板DNA 2 μL，Taq聚合酶預混體系25 μL，剩余體積用無菌蒸餾水補足。

8. 根據權利要求6所述的金邊土鱉快速鑒別方法，其特征在于，PCR反應程序為：94℃預變性5min；94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸45s，35個循環；72℃延伸10 min；PCR擴增反應在ABI Veriti 梯度PCR儀上進行；PCR完成后，取5 μL產物進行電泳檢測，電泳條件為電壓90V，電泳時間30min。