[發明專利]功能化溫度敏感型聚合物及其制備方法與在（PTM）蛋白質檢測中的應用

有效

• 申請號: 201711266324.X
• 申請日: 2017-12-05
• 公開（公告）號: CN107964066B
• 公開（公告）日: 2019-11-26
• 發明（設計）人: 錢小紅;秦偉捷;劉彤;張萬軍
• 申請（專利權）人: 北京蛋白質組研究中心
• 主分類號: C08F220/54
• 分類號: C08F220/54;C08F220/06;C08F8/32;G01N33/68;G01N21/76
• 代理公司: 11245 北京紀凱知識產權代理有限公司
• 代理人: 關暢;劉鑫鑫<國際申請>=<國際公布>=

本發明公開了功能化溫度敏感型聚合物及其制備方法與在(PTM)蛋白質檢測中的應用。該功能化溫度敏感型聚合物的結構式如式Ⅰ所示：式Ⅰ中，R為CH₂，r值為0或1，m為20～750之間的任意自然數，n為110～1120之間的任意自然數；為辣根過氧化物酶單元。本發明的功能化溫度敏感型聚合物是通過自由基聚合反應得到的帶有大量可修飾位點的線型聚合物，經功能化修飾后可得到攜帶多個HRP和大量三苯基磷基團的溫度敏感型聚合物。與傳統方法中使用只攜帶單個HRP的抗體策略相比，HRP和三苯基磷基團數量的增加可有效提高其與疊氮標記目標蛋白的結合能力以及化學發光的信號放大效果。

技術領域

本發明涉及功能化溫度敏感型聚合物及其制備方法與在(PTM)蛋白質檢測中的應用，屬于分析技術領域。

背景技術

蛋白質免疫印跡法(Western Blot，WB)是一種檢測復雜生物樣本中蛋白質表達與分布的分析技術，已在生物學研究中廣泛應用數十年，可以進行定性及半定量分析，是現代生物醫學、生物化學及免疫遺傳學等領域研究的有力工具。在此技術中，目標蛋白通過SDS-PAGE分離并轉移到PVDF膜，使用抗體進行孵育識別目標蛋白，并通過抗體連接酶(例如辣根過氧化物酶(HRP))與底物進行化學發光反應，從而顯色產生顏色信號達到檢測目的。傳統的WB技術是基于抗體對目標蛋白的特異性識別進行檢測，因此WB檢測的特異性和靈敏度主要依賴于抗體的質量和所連接HRP的性能。在WB檢測中抗體可能會對其他非目標蛋白產生非特異性吸附而出現假陽性結果，而且抗體本身存在制備周期長和批次不穩定等缺點，特別是針對蛋白質翻譯后修飾 (Post-translational modifications，PTMs)的WB檢測仍然存在很多難點。PTMs是指在蛋白質的不同氨基酸側鏈發生的各種動態化學修飾，參與各種細胞進程并對蛋白質進行功能調控，修飾種類和修飾含量的異常與多種人類重大疾病密切相關，因此深入檢測分析PTMs能夠為疾病的發生發展研究、疾病診斷標志物的發現提供有意義的靶點信息。但因其種類繁多且豐度普遍較低，對其分析手段提出了嚴峻的挑戰。研究發現在使用抗體進行蛋白質PTMs的WB分析時，抗體往往對蛋白質的氨基酸序列和結構域存在一定依賴和偏性，難以高特異性的識別和分辨體積較小的PTMs，例如磷酸化修飾或O-GlcNAc糖基化修飾等。此外，對于糖基化修飾或精氨酸/組氨酸磷酸化修飾，因其免疫原性差或高度不穩定，開發抗體本身就極具挑戰，因此極大的限制了 WB技術在PTMs研究中的應用。同時抗體所連接的HRP數量少，信號放大倍數有限，因此其檢測靈敏度較差。近年來針對這些問題也發展了以納米顆粒、石墨烯氧化物等作為固相載體固載多種抗體并連接大量HRP以增強其化學發光信號，從而提高WB 靈敏度的策略。然而在孵育時固載在不溶性載體上的抗體與PVDF膜上的目標蛋白形成異相反應體系，導致顯著的界面傳質阻力、非線性反應動力學以及空間位阻，從而限制了WB的檢測靈敏度和定量精度。因此，針對WB技術，迫切需要發展針對目標蛋白新的識別機制和信號放大策略。

發明內容

本發明的目的是提供功能化溫度敏感型聚合物及其制備方法與在(PTM)蛋白質檢測中的應用，通過自由基聚合反應和化學修飾三苯基磷基團和HRP的方式制備得到功能化溫度敏感型聚合物，利用該聚合物的溫度響應特性能夠實現高特異性和高靈敏度的疊氮標記(PTM)蛋白質WB檢測。

本發明提供的功能化溫度敏感型聚合物，其結構式如式Ⅰ所示：

式Ⅰ中，R為CH₂，r值為0或1，m為20～750之間的任意自然數，n為110～1120 之間的任意自然數；為辣根過氧化物酶單元。

在本發明的實施例中，式Ⅰ所示聚合物具體可為下述式Ⅰ-A所示聚合物，

式Ⅰ-A中，m為20～750之間的任意自然數，n為110～1120之間的任意自然數；為辣根過氧化酶單元。