[發明專利]功能化溫度敏感型聚合物及其制備方法與在（PTM）蛋白質檢測中的應用

有效

• 申請號: 201711266324.X
• 申請日: 2017-12-05
• 公開（公告）號: CN107964066B
• 公開（公告）日: 2019-11-26
• 發明（設計）人: 錢小紅;秦偉捷;劉彤;張萬軍
• 申請（專利權）人: 北京蛋白質組研究中心
• 主分類號: C08F220/54
• 分類號: C08F220/54;C08F220/06;C08F8/32;G01N33/68;G01N21/76
• 代理公司: 11245 北京紀凱知識產權代理有限公司
• 代理人: 關暢;劉鑫鑫<國際申請>=<國際公布>=

1.一種聚合物，其特征在于：所述聚合物如式Ⅰ所示：

式Ⅰ中，R為CH₂，r值為0或1，m為20～750之間的任意自然數，n為110～1120之間的任意自然數；為辣根過氧化物酶單元。

2.根據權利要求1所述的聚合物，其特征在于：所述聚合物為下述式Ⅰ-A所示聚合物，

式Ⅰ-A中，m為20～750之間的任意自然數，n為110～1120之間的任意自然數；

為辣根過氧化酶單元。

3.權利要求1或2所述的聚合物的制備方法，包括如下步驟：

(1)在引發劑存在的條件下，溫敏單體和功能單體經自由基聚合反應得到式Ⅱ所示溫度敏感型聚合物；

所述溫敏單體為N-異丙基丙烯酰胺；

所述功能單體為丙烯酸或丁烯酸；

式Ⅱ中，R為CH₂，r值為0或1，m為20～750之間的任意自然數，n為110～1120之間的任意自然數；

(2)式Ⅲ所示辣根過氧化物酶和式Ⅳ所示施陶丁格試劑發生親核取代反應，得到式Ⅴ所示功能試劑；

(3)式Ⅱ所示溫度敏感型聚合物與式Ⅴ所示功能試劑經氨基-羧基偶聯反應，得到所述聚合物。

4.根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于：步驟(1)中，所述溫敏單體與所述功能單體的摩爾比為1：1～7：1；和/或，

所述引發劑為過硫酸鉀、過硫酸銨和過硫酸鈉中任一種；所述引發劑的用量為所述溫敏單體質量的5％～50％；和/或，

所述自由基聚合反應的溫度為50～80℃，時間為8～12小時；和/或，

所述自由基聚合反應在水中進行；和/或，

所述自由基聚合反應在惰性氣氛中進行；和/或，

步驟(2)中，式Ⅳ所示施陶丁格試劑與式Ⅲ所示辣根過氧化物酶的比例為(0.5～2)mM：(5～20)mg/mL；和/或，

所述親核取代反應的溫度為20～25℃，時間為0.5～2小時；和/或，

所述親核取代反應在磷酸鹽緩沖液與有機溶劑的混合液中進行；所述有機溶劑為二甲基亞砜或N，N-二甲基甲酰胺；所述磷酸鹽緩沖液與所述有機溶劑的體積比為20：1～4：1；和/或，

步驟(3)中，所述溫度敏感型聚合物與所述功能試劑的質量比為1：1～1：6；和/或，

所述氨基-羧基偶聯反應的溫度為20～25℃，時間為2～12小時；和/或，

所述氨基-羧基偶聯反應在2-(N-嗎啡啉)乙磺酸緩沖溶液中進行。

5.權利要求1或2所述的聚合物在溫度為33～45℃形成的自組裝產物。

6.權利要求1或2所述的聚合物或權利要求5所述的自組裝產物在利用蛋白質免疫印跡法對疊氮標記蛋白質或其翻譯后修飾分析檢測中的應用。

7.利用權利要求1或2所述的聚合物或權利要求5所述的自組裝產物采用蛋白質免疫印跡法對疊氮標記蛋白質或其翻譯后修飾進行分析檢測的方法，其特征在于：所述方法通過所述聚合物中的三苯基磷與所述疊氮標記蛋白質或其翻譯后修飾中的疊氮基團之間的施陶丁格連接反應，與吸附于聚偏二氟乙烯膜上的疊氮標記蛋白質或其翻譯后修飾進行特異性結合，并利用所述聚合物的溫度響應特性導致的自組裝行為，實現所述疊氮標記蛋白質或其翻譯后修飾的檢測分析。

8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于：所述方法的具體步驟如下：

(1)將疊氮標記蛋白質或其翻譯后修飾樣品進行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離并轉移到聚偏二氟乙烯膜上，封閉；

(2)將所述聚合物溶解于含有表面活性劑的緩沖溶液中，將其與聚偏二氟乙烯膜接觸孵育進行所述施陶丁格連接反應，升高溫度使所述聚合物在目標蛋白區域內自組裝聚集；

(3)使用所述含有表面活性劑的緩沖溶液清洗聚偏二氟乙烯膜除去非特異性吸附的所述聚合物及其自組裝，對清洗后的聚偏二氟乙烯膜進行化學發光檢測。