[發明專利]一種牛干擾素α生物學活性檢測方法

在審

• 申請號: 201711264261.4
• 申請日: 2017-12-05
• 公開（公告）號: CN107916301A
• 公開（公告）日: 2018-04-17
• 發明（設計）人: 張振韜;趙俊;王明麗;甘霖;梅志強;蔣敏之;王利利
• 申請（專利權）人: 蕪湖英特菲爾生物制品產業研究院有限公司
• 主分類號: C12Q1/6897
• 分類號: C12Q1/6897;C12N15/85
• 代理公司: 北京科家知識產權代理事務所(普通合伙)11427
• 代理人: 陳娟

技術領域

本發明涉及一種牛干擾素α生物學活性檢測方法，屬于干擾素活性檢測技術領域。

背景技術

干擾素(IFN)是細胞和機體受到病毒感染，或者受核酸、細菌內毒素和促細胞分裂素等的作用后，由受體細胞分泌的一種廣譜抗病毒糖蛋白。根據干擾素的來源和理化性質，可將其分為I型、II型和III干擾素。I型干擾素包括IFN-α，IFN-β，和IFN-τ；II型干擾素即IFN-γ；III干擾素即IL-28A，IL-28B和IL-29。

IFN-α有四個主要功能。第一，可以使感染病毒的細胞及其周圍細胞進入內源性抗病毒狀態，限制病毒的傳播；第二，維持天然免疫反應處于平衡狀態，促進抗原遞呈和NK細胞功能的同時抑制促炎信號通路和細胞因子的產生；第三，激活獲得性免疫系統，促進高親和力抗原特異性T細胞的產生，促進B細胞反應和免疫記憶；第四，具有抑制病毒增殖的作用。

IFN-α的作用機制在25年前已經闡明，IFN與受體結合激活受體相關JAK1和TYK2，使STAT1和STAT2絡氨酸磷酸化，磷酸化的STAT1和STAT2形成二聚體并轉移入核，裝配IFN調節因子9(IRF9)形成3聚體的IFN刺激因子3(ISGF3)。ISGF3與其同源DNA序列(IFN刺激反應元件，ISREs)結合，直接激活ISGs轉錄，使宿主細胞進入抗病毒狀態。ISG抑制病毒的途徑主要有，抑制病毒的轉錄、翻譯和核酸復制；降解病毒核酸；改變宿主細胞脂代謝。因此，只要檢測到ISGs的啟動子活性增加就可以直接反應IFN-α的生物學活性。

IFN-α可以經JAK-STAT信號轉導途徑激活Mx啟動子(Mx promoter，Mxp)，促進Mx的表達，Mx能夠抑制負鏈RNA病毒復制。在牛中存在Mx和Mx2兩種蛋白，其中Mx起主要作用。Mxp有較好的專一性，它不能被白細胞介素和腫瘤壞死因子等其它細胞因子啟動，能夠準確反應IFN-α生物學功能。

目前檢測干擾素生物學活性主要有3種方法：病毒復制抑制、噬斑減少分析和細胞病變抑制。但這3種方法都容易產生較大誤差，重復性不好，準確度低。最近Mxp-Luciferase(熒光素酶)系統已經開始用于I型干擾素生物學活性檢測，該系統檢測的是IFN激活Mxp的能力，不存在假陽性；整個過程完全避免VSV等活病毒的使用，沒有生物安全的顧慮；檢測程序簡化，時間大大縮短，在IFN處理細胞后約6h即可完成檢測，檢測速度快；熒光素酶的表達可以通過儀器檢測精確量化，不僅提高了IFN定量的準確性，更便于大量樣品的高通量操作。但該方法基于質粒瞬時轉染為基礎，每次需要準備內參照質粒，并保證質粒轉染效率一致才能夠得到準確的檢測結果，因此在一般實驗室很難開展，而且需要使用熒光素酶底物，增加了使用成本。

發明內容

鑒于上述現有技術存在的缺陷，本發明的目的是提供一種利用綠色熒光蛋白(EGFP)的牛干擾素α生物學活性檢測方法，該方法不需要內參照質粒，能夠簡化檢測過程，不需要重復進行質粒轉染，提高準確性和重復性，實用性更強。

本發明的目的通過以下技術方案得以實現：

一種牛干擾素α生物學活性檢測方法，其包括以下步驟：

采用PCR擴增獲取牛Mx蛋白的Mxp的基因片段；

用PCR擴增獲得的牛Mx蛋白的Mxp的基因片段通過T4DNA連接酶替換原pEGFP-N1載體質粒中的pCMV的基因片段，構建pEGFP-N1-Mxp質粒；

用pEGFP-N1-Mxp質粒轉染細胞，并通過新霉素篩選出穩定轉染細胞株；

對篩選出的穩定轉染細胞株進行克隆化培養；

以梯度稀釋的牛干擾素α標準品制備標準曲線，確定干擾素效價與熒光值之間的數學邏輯關系；

將待檢牛干擾素α樣品加入克隆化培養后的細胞中，然后檢測熒光強度，結合標準曲線評價待檢牛干擾素α樣品的效價。

上述的牛干擾素α生物學活性檢測方法中，將待檢牛干擾素α樣品加入克隆化培養后的細胞中，需要孵育一定的時間，一般6小時左右。

上述的牛干擾素α生物學活性檢測方法中，在穩定轉染細胞株中加入牛干擾素α，會激活Mx基因啟動子活性促進細胞內EGFP的表達，通過激發光源照射后細胞發出熒光的強度與牛干擾素α的生物學活性呈正相關，因此可以定量評價牛干擾素α的生物學活性。

本發明中，Mxp是指牛Mx基因啟動子區域，pCMV是指pEGFP-N1質粒的CMV啟動子區域。

上述的牛干擾素α生物學活性檢測方法中，優選的，采用PCR擴增獲取牛Mx蛋白的Mxp的基因片段的步驟包括：