[發(fā)明專利]一種牛干擾素α生物學(xué)活性檢測(cè)方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201711264261.4
• 申請(qǐng)日: 2017-12-05
• 公開（公告）號(hào): CN107916301A
• 公開（公告）日: 2018-04-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張振韜;趙俊;王明麗;甘霖;梅志強(qiáng);蔣敏之;王利利
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 蕪湖英特菲爾生物制品產(chǎn)業(yè)研究院有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/6897
• 分類號(hào): C12Q1/6897;C12N15/85
• 代理公司: 北京科家知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙)11427
• 代理人: 陳娟

1.一種牛干擾素α生物學(xué)活性檢測(cè)方法，其包括以下步驟：

采用PCR擴(kuò)增獲取牛Mx蛋白的Mxp的基因片段；

用PCR擴(kuò)增獲得的牛Mx蛋白的Mxp的基因片段通過T4DNA連接酶替換原pEGFP-N1載體質(zhì)粒中的pCMV的基因片段，構(gòu)建pEGFP-N1-Mxp質(zhì)粒；

用pEGFP-N1-Mxp質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，并通過新霉素篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株；

對(duì)篩選出的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株進(jìn)行克隆化培養(yǎng)；

以梯度稀釋的牛干擾素α標(biāo)準(zhǔn)品制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定干擾素效價(jià)與熒光值之間的數(shù)學(xué)邏輯關(guān)系；

將待檢牛干擾素α樣品加入克隆化培養(yǎng)后的細(xì)胞中，然后檢測(cè)熒光強(qiáng)度，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線評(píng)價(jià)待檢牛干擾素α樣品的效價(jià)。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛干擾素α生物學(xué)活性檢測(cè)方法，其特征在于，采用PCR擴(kuò)增獲取牛Mx蛋白的Mxp的基因片段的步驟包括：

根據(jù)Genebank中已公布的牛Mx蛋白的基因序列，選擇5'端含有ISRE反應(yīng)元件的啟動(dòng)子區(qū)域，設(shè)計(jì)PCR引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；

然后通過雙酶切后，再通過切膠回收純化獲得Mxp的基因片段。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛干擾素α生物學(xué)活性檢測(cè)方法，其特征在于，用PCR擴(kuò)增獲得的牛Mx蛋白的Mxp的基因片段通過T4DNA連接酶替換原pEGFP-N1載體質(zhì)粒中的pCMV的基因片段，構(gòu)建pEGFP-N1-Mxp質(zhì)粒的步驟包括：

去除pEGFP-N1載體質(zhì)粒的pCMV的基因片段；

通過T4DNA連接酶用Mxp的基因片段替換原pEGFP-N1載體質(zhì)粒中的pCMV的基因片段，構(gòu)建重組質(zhì)粒pEGFP-N1-Mxp；

轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，搖菌，提取重組質(zhì)粒，通過DNA測(cè)序獲得重組質(zhì)粒的Mxp片段的DNA序列，選擇正確序列的重組質(zhì)粒；

所述正確序列如序列1所示。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛干擾素α生物學(xué)活性檢測(cè)方法，其特征在于，用pEGFP-N1-Mxp質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，并通過新霉素篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的步驟包括：

通過轉(zhuǎn)染試劑將pEGFP-N1-Mxp質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至細(xì)胞，轉(zhuǎn)染96h后，換成含2μg/mL新霉素的完全培養(yǎng)基持續(xù)培養(yǎng)14日，篩選出具有新霉素抗性的細(xì)胞，即為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛干擾素α生物學(xué)活性檢測(cè)方法，其特征在于，所述克隆化培養(yǎng)為將篩選出的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株通過有限稀釋培養(yǎng)法培養(yǎng)，從而獲得單個(gè)細(xì)胞形成的克隆；

優(yōu)選的，在對(duì)篩選出的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株進(jìn)行克隆化培養(yǎng)的步驟中還包括對(duì)克隆后的細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，通過PCR鑒定細(xì)胞基因組中是否含有Mxp基因。

6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的牛干擾素α生物學(xué)活性檢測(cè)方法，其特征在于：Mxp的基因片段序列為序列1所示。

7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的牛干擾素α生物學(xué)活性檢測(cè)方法，其特征在于：去除pEGFP-N1載體質(zhì)粒的pCMV的方法為雙酶切法。

8.根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的牛干擾素α生物學(xué)活性檢測(cè)方法，其特征在于：所述細(xì)胞為MDBK細(xì)胞。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛干擾素α生物學(xué)活性檢測(cè)方法，其特征在于：所述的牛干擾素α標(biāo)準(zhǔn)品為公布號(hào)為CN106319006A的專利所揭示的一種重組牛α干擾素標(biāo)準(zhǔn)品的制備方法制備得到的重組牛α干擾素。

10.權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)所述的牛干擾素α生物學(xué)活性檢測(cè)方法在對(duì)天然或重組牛干擾素α進(jìn)行生物學(xué)活性檢測(cè)中的應(yīng)用。