[發明專利]檢測AR基因突變的引物和方法

在審

• 申請號: 201711261967.5
• 申請日: 2017-12-04
• 公開（公告）號: CN108018342A
• 公開（公告）日: 2018-05-11
• 發明（設計）人: 桑志高;吳鵬飛;王淑一
• 申請（專利權）人: 合肥艾迪康臨床檢驗所有限公司
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869;C12Q1/6886;C12N15/11
• 代理公司: 浙江杭州金通專利事務所有限公司 33100
• 代理人: 黃素萍

本發明公開了一種檢測與前列腺癌有關的AR基因突變的引物和方法。本發明應用RT?PCR和Sanger測序兩項技術，僅使用一對擴增引物和測序引物就可實現位于5號外顯子上的主要突變位點W741L/C、8號外顯子上的主要突變位點H874Y，F876L和T877A上突變情況的檢測，繼而能夠方便快捷、經濟，準確地診斷患者AR基因的突變情況。本發明所述引物和方法，準確、檢測高效。

技術領域

本發明屬于醫學及生物技術領域，一種使用RT-PCR及Sanger測序法檢測AR點突變的方法和引物。

技術背景

前列腺癌目前發病率非常高，特別是歐美國家，根據美國國家腫瘤研究所和國家衛生統計中心數據，前列腺癌的發病自1975～2009年以來始終是男性惡性腫瘤發病之首，約160～180/100 000，2001～2005年全美國男性惡性腫瘤的發病率平均562.3/100 000，前列腺癌為158.2/100 000，在所有人群中居第二，僅次于肺和支氣管癌，是最嚴重危害男性健康的疾病。前列腺腫瘤的生長幾乎完全依靠雄激素受體(AR)途徑，因此對前列腺癌的治療圍繞阻斷這條途徑為中心來制定。然而在開始階段應用去勢對抗雄激素治療前列腺癌的治療非常有效，但腫瘤發展到進展期，對抗雄激素治療無效，出現骨轉移等，眾多文獻報道前列腺癌的發病進展轉移多有AR的突變，在前列腺癌的進展過程中起著重要作用。

人類的AR基因定位于X染色體(Xq11-12)，包含8個外顯子和7個內含子，全長90kb，編碼918個氨基酸。AR一般由4個結構區域組成，N端(氨基端)轉錄激活區(NTD)、DNA結合結構區(DBD)、鉸鏈區和配體結合結構區(LBD)，不同的結構區域具有特定的功能。外顯子1編碼于N-端區域，和5’非轉錄區，外顯子2和3編碼于DNA結合結構區(DBD)，外顯子4-8編碼在鉸鏈區和配體結合區(LBD)。AR基因突變包括基因片段缺失、插入、重復，單個堿基的缺失、插入、點突變等，突變點多發生在LBD，主要為單堿基點突變。目前，AR基因70多個錯義突變已經確定，其中H874Y，F876L，T877A和W741L/C四個突變位點會引起耐藥性和疾病發展得到公認。

目前用于AR突變檢測的方法主要有：Sanger測序法和NGS(Next–generationsequencing technology)測序。Sanger測序法目前是臨床應用于檢測基因突變極其普遍的一種手段，應用靈活，但其靈敏度不高，且每次測序長度有限，一般一次只能測800bp左右的基因片段。目前AR測序主要以DNA為模板進行PCR擴增，引物測序片段的限制，通常兩個熱點區域需要分別擴增，增加了成本。NGS測序技術，即高通量測序技術，具有通量大、時間短、精確度高和信息量豐富等優點，適用于沒有明確候選基因或候選基因數量較多的大樣本病例篩查。NGS對于有致病基因位點明確并且數量有限的單基因遺傳疾病的致病基因的檢測，成本太高且操作相對于Sanger法更為復雜，對數據分析的要求較高。

發明內容

鑒于目前AR突變位點檢測方法的不足，本發明提供了一種以cDNA為模板使用Sanger測序法檢測AR點突變的引物，所述擴增引物的核苷酸序列包括：

AR-F 5’-TGGCTTCCGCAACTTACACG-3’

AR-R 5’-CAGAAAGGATCTTGGGCACT-3’

所述測序引物的核苷酸序列包括：

AR-F 5’-TGGCTTCCGCAACTTACACG-3’

AR-R 5’-CAGAAAGGATCTTGGGCACT-3’。

進一步地，所述擴增引物在如下擴增體系中使用：10μl的2×KOD Buffer，0.4μl的KOD酶，4μl的d NTP；10μM引物AR-F和10μM AR-R各0.5ul；3.6μl去離子水；1μl的cDNA模版。