[發(fā)明專利]與水稻紅褐色穎殼性狀有關(guān)的sgRNA、CRISPR/Cas9載體、載體構(gòu)建、應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201711258265.1
• 申請(qǐng)日: 2017-12-04
• 公開（公告）號(hào): CN108034656A
• 公開（公告）日: 2018-05-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 蒲志剛;向小利;王平
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)核技術(shù)研究所
• 主分類號(hào): C12N15/113
• 分類號(hào): C12N15/113;C12N15/82;C12N15/11;C12Q1/6895;A01H5/00;A01H4/00;A01H6/46
• 代理公司: 成都賽恩斯知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 51212
• 代理人: 張帆

本發(fā)明公開與水稻紅褐色穎殼性狀有關(guān)的sgRNA、CRISPRCas9載體、載體構(gòu)建、應(yīng)用，克服需要在OsCHI兩個(gè)等位基因都突變才得到褐殼水稻的缺陷。本發(fā)明：提供sgRNA片段，包含特異性靶向水稻肉桂醇脫氫酶CAD基因第五個(gè)外顯子的gRNA。該sgRNA具體是T1、T2、T3。提供包含上述sgRNA片段的CRISPR/Cas9基因編輯載體及其構(gòu)建方法，該載體可編輯水稻肉桂醇脫氫酶CAD基因。提供這些片段與載體在獲得具有紅褐色穎殼和莖結(jié)性狀水稻材料中的應(yīng)用。提供用于檢測(cè)CRISPR/Cas9?CAD基因重組的引物序列。本發(fā)明可降低傳統(tǒng)育種成本，提高雜交水稻制種機(jī)械化水平，縮短育種周期。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及與紅褐色穎殼性狀水稻有關(guān)的一種sgRNA片段、 CRISPR/Cas9編輯載體、載體構(gòu)建方法，及應(yīng)用。屬于基因工程領(lǐng)域。

背景技術(shù)

利用自然突變和人工突變，水稻種質(zhì)資源中能夠獲得少量不同穎殼顏色的育種材料。借助穎殼的不同顏色可以在水稻機(jī)械化制種中將不育系上結(jié)的雜種與一同用收割機(jī)收獲的恢復(fù)系種子準(zhǔn)確地分開，因而不同穎殼顏色在雜交水稻制種中具有很高的技術(shù)價(jià)值。但是如果利用傳統(tǒng)常規(guī)雜交、回交的方法將殼色性狀轉(zhuǎn)育到恢復(fù)系、保持系且不改變?cè)胁牧系奶匦裕枰甑臅r(shí)間才能實(shí)現(xiàn)。

授權(quán)公告號(hào)為CN 104017821 B的中國(guó)發(fā)明專利公開了一種定向編輯穎殼顏色決定基因OsCHI創(chuàng)制褐殼水稻材料的方法。該方法主要內(nèi)容包括在穎殼顏色決定基因OsCHI外顯子區(qū)選取靶標(biāo)片段并構(gòu)建植物 CRISPR/Cas9打靶重組載體，將該重組載體導(dǎo)入水稻細(xì)胞并再生成苗，在載體中的表達(dá)框的作用下對(duì)水稻細(xì)胞進(jìn)行剪切，觸發(fā)水稻細(xì)胞DNA 的自我修復(fù)功能。再通過對(duì)再生株系基因組目標(biāo)片段的測(cè)序，獲取攜帶兩個(gè)等位OsCHI基因同時(shí)發(fā)生功能缺失突變的株系，經(jīng)過穎殼顏色鑒定，即為所創(chuàng)制的褐殼水稻材料。該方法不足之處在于：需要在OsCHI兩個(gè)等位基因都突變才能產(chǎn)生褐殼水稻，同時(shí)對(duì)兩個(gè)基因進(jìn)行突變的效率較低，難以獲得兩個(gè)基因突變的純合突變體。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的就是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種可以快速獲得紅褐色穎殼性狀水稻材料的技術(shù)方案。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明首先提供一種sgRNA片段，該sgRNA片段能夠針對(duì)同一基因進(jìn)行編輯，其技術(shù)方案如下：

一種sgRNA片段，其特征在于：包含特異性靶向水稻肉桂醇脫氫酶 CAD基因的第五個(gè)外顯子的gRNA。

上述sgRNA片段包含的gRNA特異性靶向于水稻肉桂醇脫氫酶 CAD基因(Oryzasativa(indica cultivar-group)cinnamyl-alcohol dehydrogenase(CAD)gene，GenBank:DQ234272.1)的第五個(gè)外顯子，堿基序列如SEQ ID NO.6。

上述sgRNA片段，包括三個(gè)sgRNA片段，分別是：命名為T1的 sgRNA片段，堿基序列如SEQ ID NO.1；命名為T2的sgRNA片段，堿基序列如SEQ ID NO.2；命名為T3的sgRNA片段，堿基序列如SEQ ID NO.3。

上述三個(gè)sgRNA片段是選擇水稻肉桂醇脫氫酶CAD基因(Oryza sativa(japonicacultivar-group)cinnamyl alcohol dehydrogenase(CAD)gene) 上的三個(gè)sgRNA靶向位點(diǎn)，參考http://cbi.hzau.edu.cn/cgi-bin/CRISPR靶位點(diǎn)預(yù)測(cè)而設(shè)計(jì)，用http://www.rgenome.net/cas-offinder/網(wǎng)址分析脫靶效應(yīng)，最終選擇確定。

上述sgRNA片段可用于制備水稻肉桂醇脫氫酶基因CRISPR/Cas9 基因編輯載體。本發(fā)明進(jìn)一步提供技術(shù)方案：上述sgRNA在制備水稻肉桂醇脫氫酶基因CRISPR/Cas9基因編輯載體中的應(yīng)用。