[發明專利]與水稻紅褐色穎殼性狀有關的sgRNA、CRISPR/Cas9載體、載體構建、應用

在審

• 申請號: 201711258265.1
• 申請日: 2017-12-04
• 公開（公告）號: CN108034656A
• 公開（公告）日: 2018-05-15
• 發明（設計）人: 蒲志剛;向小利;王平
• 申請（專利權）人: 四川省農業科學院生物技術核技術研究所
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/82;C12N15/11;C12Q1/6895;A01H5/00;A01H4/00;A01H6/46
• 代理公司: 成都賽恩斯知識產權代理事務所(普通合伙) 51212
• 代理人: 張帆

1.sgRNA片段，其特征在于：包含特異性靶向水稻肉桂醇脫氫酶CAD基因的第五個外顯子的gRNA。

2.根據權利要求1所述的sgRNA片段，其特征在于：包括命名為T1、堿基序列如SEQ IDNO.1的sgRNA，命名為T2、堿基序列如SEQ ID NO.2的sgRNA，命名為T3、堿基序列如SEQ IDNO.3的sgRNA。

3.包含權利要求2所述的sgRNA片段的CRISPR/Cas9基因編輯載體。

4.根據權利要求3所述的CRISPR/Cas9基因編輯載體，其特征在于：包括由OsU6a啟動子調控T1 sgRNA片段表達的表達框OsU6a::T1、由OsU6b啟動子調控T2 sgRNA片段表達的表達框OsU6b::T2、由OsU6c啟動子調控T3 sgRNA片段表達的表達框OsU6c::T3、由玉米泛素Ubiqutin啟動子調控Cas9表達的表達框。

5.權利要求3或4所述的CRISPR/Cas9基因編輯載體的構建方法，其特征在于：將分別連接OsU6a、OsU6b、OsU6c啟動子與Ploy-T終止子的T1、T2、T3通過Bsa I酶連入pYLCRISPR/Cas9Pubi-H質粒，構建得到Pubi::Cas9-OsU6a::T1-OsU6b::T2-OsU6c::T3表達盒，獲得pYLCRISPR/Pubi::Cas9-OsU6a::T1-OsU6b::T2-OsU6c::T3編輯基因的最終載體。

6.權利要求3或4所述的CRISPR/Cas9基因編輯載體在特異針對水稻肉桂醇脫氫酶基因進行基因編輯的應用。

7.根據權利要求6所述的應用方法，其特征在于：將構建好的載體轉入農桿菌EHA105用于農桿菌介導的水稻日本晴愈傷組織遺傳轉化，并將愈傷組織誘導培養獲得再生植株。

8.權利要求1或2所述的sgRNA片段、權利要求4所述的CRISPR/Cas9基因編輯載體在制備紅褐色穎殼性狀水稻材料中的應用；所述紅褐色穎殼性狀水稻材料含有或者不含有SgRNA:Cas9:HPT轉基因片段。

9.權利要求1或2所述的sgRNA片段、權利要求4所述的CRISPR/Cas9基因編輯載體在水稻機械制種中的應用。

10.用于檢測CRISPR/Cas9-CAD基因重組的引物組合1F、1R，其特征在于，1F、1R堿基序列分別如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示。